| 研究課題/領域番号 |
18K19633
|
|---|
| 研究機関 | 東北大学 |
|---|
研究代表者 |
吉田 卓史 東北大学, 歯学研究科, 助教 (30455795)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2021-03-31
|
| キーワード | 骨リモデリング / 光遺伝学 |
|---|
| 研究実績の概要 |
骨リモデリングは骨の中で骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞の3種類の細胞が互いに連携することにより成し遂げられている。この骨リモデリングの詳細なメカニズムを解明することは骨粗鬆症などを初めとする骨に関する様々な病気の治療や予防法の開発につながる重要なテーマである。しかしながら骨関連細胞は固い無機気質の中に埋没しているために単利も難しく、ましてや細胞の局所に任意に機械的刺激を負荷することは難しく、骨リモデリングの詳細な解析は進んでいない。本研究ではオプトジェネティクス(光遺伝学)法を利用することによりこの問題を解決することを目的としている。オプトジェネティクス法の骨子は光応答性タンパク質を機能性タンパク質に結合することにより、時空間的に任意にその機能をon/offすることが出来ることである。本研究では機械刺激により活性化する単量体型GTPaseであるRap1に着目し、この機能を光により制御可能なタンパク質の創生を目指した。昨年度よりこの新規光機能性タンパク質の開発を行ってきたが、昨年度は当初の予定通りには光により作動しなかった。そこで本年度は光応答性タンパク質をより小さくすることにより機能性タンパク質の活性を阻害しないようにする改変を加え、また同時に光応答性モジュールと機能性モジュールをつないでいるリンカーの長さを変化させたものを数種類作成してその光応答性を細胞に発現させて測定した。その結果、光照射に応答して新規タンパク質が細胞膜に移行し、細胞の形態を変化させることを見出した。リンカーの長さの違いについてはあまり顕著な違いは見られなかった。一方、光照射そのものによる細胞毒性も生じていることが考えられる結果も得ており、より低光刺激で活性を評価する手法も必要だと考えられる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度は前年度に明らかとなった光応答性タンパク質の問題を解決するために、光応答性タンパク質の交換とリンカーの長さを複数種作成することを行った。その結果、より小型の光応答性モジュールをつけることにより光照射による細胞膜移行を起こすことが出来た。また、リンカーの長さによる光活性の違いはそれほどないことが明らかになった。また、前年度に問題と考えられた顕微鏡上の反応温度について検討を行った。恒温槽による潅流液の37℃での加温を行ったうえで光照射を行ったが温度による影響は大きくないことが明らかとなった。それよりも光を照射することが細胞にとって毒性があると考えられる結果が得られた。そのために光照射強度を弱くしたり、光照射時間を短くしたりしたが完全には毒性をなくすには至っていない。今後は光毒性をより減少させたうえで、細胞骨格に対する新規光応答性タンパク質の活性を向上させるように最適化を行って当初の目的を達成する。
|
| 今後の研究の推進方策 |
光応答性タンパク質の構造最適化を引き続き行うことにより、より光活性が高いタンパク質の創生を目指す。機能ドメインへの変異の導入、光応答性モジュールもしくは機能性モジュールの別のタンパク質への置換も検討する。光の照射においては現在使用しているキセノンランプを用いた照射波長切り替え装置ではこれ以上短い光照射時間を達成できないため、LED光源を導入することにより光毒性の低減を達成する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度の結果より本年度では顕微鏡上で長時間細胞を37℃で培養するための温度チャンバーを導入する予定としていた。しかしながら本年度の研究結果より細胞の培養温度よりも強い光を長時間照射することによる細胞毒性の方が問題であることが新たに分かった。そのために光照射時間をコントロールしやすいLED光源の導入の方が優先であると判断した。そのために複数のLED光源の選定を行っていたが導入に時間がかかりまだ購入できていない。次年度はこちらの購入と光応答性タンパク質の開発にかかわる酵素やDNAの購入を計画的に進める予定である。
|
