研究課題
個体発生や細胞の運命決定において、マスター転写因子群が中心的な役割を果たす。これらの蛋白質は、エンハンサーと呼ばれるゲノム上の特定の転写制御領域に結合することで、標的遺伝子の発現を制御し生物学的機能を発揮する。次世代シーケンサーを用いたクロマチン免疫沈降―シークエンス（ChIP-seq）法の発展により、マスター転写因子群の結合部位がゲノムスケールで明らかになってきた。しかしながら、数千領域にも及ぶ膨大な数の結合領域の中で、機能的に重要なエンハンサー領域を明らかにする手法はほとんど開発されておらず、その機能解析は未だ困難を極めている。そこで本研究では、ゲノム編集技術、分子バーコードおよび一細胞RNA-seq解析技術を融合することで、転写制御領域の機能を一細胞単位で解析する新しい研究手法の確立を目指した。研究代表者がこれまで取り組んできた骨発生におけるマスター転写因子群による骨形成転写ネットワークをモデルに、一細胞エンハンサースクリーニング法を開発し、機能的な骨形成転写ネットワークの構築を目指した。本年度はまず骨形成を担う骨芽細胞において、マスター転写因子群のゲノム結合部位データ、エピゲノムデータ、転写産物データおよび脊椎動物ゲノム配列保存情報を統合することで、骨発生において特異的にはたらくエンハンサー候補を選定した。公共データーベースおよび、研究代表者が別プロジェクトで取得した骨発生マスター転写因子群のChIP-seqでーたをもとに、有望なエンハンサー候補を100領域選定した。現在、これらの候補領域に対してガイドRNAを設計し、CRISPR/Cas9システムを用いたエンハンサー欠損実験を予定している。
2: おおむね順調に進展している
すでにバイオインフォマティクスを用いたエンハンサー候補領域を得ており、その一部に関してはガイドRNAの設計まで終了しているため
本年度はまず、各エンハンサー候補領域を標的とするガイドRNAウイルスライブラリーを作製する。本研究では、一種類のウイルスベクターから2種類のガイドRNA・薬剤耐性遺伝子・蛍光蛋白質・分子バーコードが同時に発現するコンストラクトを構築する。2種類のガイドRNAを一つのセットとして、一つのエンハンサー候補領域を挟み込み、欠損するように設計する。このような1ベクターあたり２種類のガイドRNAを用いたゲノム欠損法は、その欠損効率が低い可能性がある。そのため、もし基礎検討の結果、効率が低いことが明らかになった場合は、1ベクターあたり1種類のガイドRNAを有するベクターを使用した実験に切り替える。ベクター構築後、これらを統合し293T細胞に遺伝子導入し、レンチウイルスライブラリーを作製する。Cas9を恒常的に発現する骨芽細胞を作製し、本ライブラリーを感染させる。これにより、細胞内に発現する分子バーコード配列を読むことで、ガイドRNAセットの情報と、欠損したエンハンサー領域の情報の対応付けが可能となると考えられる。また感染させるウィルス力価を調整することで、異なる組み合わせの様々なガイドRNAを発現させることが可能になるため、異なる組み合わせのエンハンサー領域が欠損した細胞群が得られると考えられる。
当初予定していた実験の一部を、公共データーベースに既に登録されているデータで代用可能であることが分かったため、今年度の使用額が減少した。一方、現在予定している実験系では、実験遂行の効率性が低い可能性が出てきたため、別の系を使用した実験の検証の必要性が生じた。そのため、昨年度未使用の予算を本検証に回す予定である。
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Nat Commun.
巻: 9 ページ: 4216
10.1038/s41467-018-06469-7.
