2019 年度実施状況報告書

CPEの網羅的薬剤耐性遺伝子の変異解析と質量分析法を組み合わせた迅速検出法

研究課題

研究課題/領域番号	18K19698
研究機関	国際医療福祉大学
研究代表者	船島由美子国際医療福祉大学, 福岡保健医療学部, 助教 (70752814)
研究分担者	永沢善三国際医療福祉大学, 福岡保健医療学部, 教授 (80706820) 佐藤謙一国際医療福祉大学, 福岡保健医療学部, 准教授 (90505687)
研究期間 (年度)	2018-06-29 – 2021-03-31
キーワード	LAMP法 / CPE
研究実績の概要	わが国が2016年に発表した薬剤耐性対策（AMR）アクションプランでは、2020年までに薬剤耐性菌として蔓延傾向にあるカルバペネム系耐性腸内細菌科細菌、特にCarbapenemase producing Enterobacteriaceae（CPE）を中心とした薬剤耐性菌検出率の低減が途上国に求められた。薬剤耐性菌の蔓延を予防するためには、細菌が保有する薬剤耐性遺伝子を網羅的に検出することが必須と言える。現在、一部の医療施設ではPCR法での薬剤耐性遺伝子を市販のキット類で検査しているが、耐性遺伝子領域に変異が存在する場合には検出できないため、変異が存在しても検出できる網羅的なプライマーの開発が必要である。また、開発途上国では残念ながら高額な遺伝子検査機器が普及していない現状にあるため、薬剤耐性菌の蔓延を防止する対策の恐れが懸念される。そこで、本研究ではCPE（カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌）をターゲットに、開発途上国でも高額な機器を必要とせず、迅速で網羅的に薬剤耐性菌遺伝子をLoop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)法にて検出する検査技術の構築を目的としている。①薬剤耐性遺伝子領域の塩基配列を比較解析し、変異部分が存在しても増幅可能なプライマーの設計を実施する。②開発途上国での使用においては、高額な機器を必要としない策として薬剤耐性遺伝子の増幅にヒートブロック、検出には蛍光反応を利用した目視判定でかつ簡易な検査システムを構築する。③現状の薬剤感受性試験による表現型を用いた薬剤耐性菌鑑別をより迅速に実践するため、最先端の質量分析装置でのスペクトル波形と組み合わせた薬剤耐性遺伝子の網羅的な検出技術を開発する。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由前年度はCarbapenemase主要5ファミリーとして、KPC（Klebsiella pneumoniae arbapenemase）、NDM（New Delhi metallo-beta-lactamase）、VIM（Verona integron-encoded metallo-beta-lactamase）、OXA-48-like（Oxacillin carbapenemases-48-like）、IMP（Imipenemase metallo-beta-lactamase）に対するLAMP法のプライマー設計を行い、反応温度の比較を実施した。今年度は、NDMとKPCについては、マルチプルアライメント結果より、全てのLAMP法プライマーと全変異型の塩基配列が一致しているため全変異型の検出が推測できた。しかし、LAMP法プライマー設計において多様化しており問題となるのがIMPである。IMPについては変異型の多さより、1セットのLAMP法プライマーでの対応は困難なためIMP 全ての変異型をマルチプルアライメントの結果からグループ1からグループ3の3つのグループに分類し更にプライマーを設計した。グループ1はIMP-1, -3, -4, -5, -6, -7, -9, -10, -15, -25, -26, -28, -29, -30, -34, -38, -40, -42, -43, -45, 5-1, -52, -53, -55, -59, -60, -61, -62, -66, -70の30の変異型を含む。グループ1のプライマーセットはわが国で頻発する変異型を多く含むことと所有菌株の関係から、今回はIMPグループ1についてのみ検証した。グループ2とグループ3については対象とする変異株の保有が無く検証ができなかったため、次年度の課題と考える。
今後の研究の推進方策	IMPのグループ2、グループ3、KPC、NDM、VIM、OXA-48-likeについても所有株は少ないがLAMP法について最終的な検証を実施予定である。また、開発途上国では残念ながら高額な遺伝子検査機器が普及していない現状にあり、薬剤耐性菌の蔓延が懸念される。薬剤耐性菌の蔓延を防止するため、高価な遺伝子検査機器を保有していない施設や国でも簡易に実施できる遺伝子検査法として、専用の機器を必要とせず、簡易・迅速に薬剤耐性遺伝子のタイプが鑑別できる遺伝子増幅法としてLAMP法の導入を考える。その方法として、増幅にヒートブロックを用い、また、検出には蛍光反応を利用して目視判定を行えるように検討予定である。医療施設において慢性疾患治療中の患者や免疫低下症患者もしくは高齢者で抗菌剤投与前患者、長期抗菌剤投与患者などは、迅速な耐性菌検査情報を必要とする。今後は抗菌剤治療に貢献できるさらなる迅速耐性菌情報の提供の試みとして、検体から直接DNA抽出を行い、LAMP法を実施する予定である。
次年度使用額が生じた理由	CPE約100株についてLAMP法の測定を予定していたが、LAMP法のプライマー設計に時間を要したため、CPE約100株のLAMP法測定が実施出来ずに次年度の課題へと持ち越した。次年度は、LAMP法の消耗品を購入予定である。