ヒスタミンに応答するインテリジェント人工細胞の開発

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19944
• 研究機関: 沖縄科学技術大学院大学
• 研究代表者: 横林 洋平 沖縄科学技術大学院大学, 核酸化学・工学ユニット, 准教授 (70769752)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2020-03-31
• キーワード: 人工細胞 / リボスイッチ / 合成生物学 / RNA工学

研究実績の概要

本研究の目的・課題は：（１）SELEX法により新たに選択されたヒスタミンアプタマーを用いて、無細胞翻訳系において、ヒスタミンに応答するRNA遺伝子スイッチ（リボスイッチ）を設計する。（２）同リボスイッチをリポソームに内包し、ヒスタミンに応答する人工細胞を作成する。（３）培養細胞により放出されるヒスタミンに応答する人工細胞を作成する。本年度は主に（１）を遂行した。
ヒスタミンアプタマーの解析：SELEX法を用いて新規に発見したヒスタミンアプタマーA1について、各種化学的解析を行った。等温滴定型カロリメトリー（ITC）により解離定数および熱力学的定数の測定を行った。また、変異解析により、分子認識機能に重要な塩基を特定した。ヒスチジン、イミダゾールなど、類似化合物に対する結合能評価を行い、ヒスタミンに対する特異性を確認した。これらの基礎情報は下記のリボスイッチ設計に活用した。
ヒスタミン応答性リボスイッチの作成：無細胞翻訳系（PUREfrex）において機能するヒスタミン応答性リボスイッチの、半合理的設計法による設計および評価を行った。RNA二次構造予測を利用して、約２０種類のリボスイッチ配列を設計し、その中からヒスタミン存在下で、最大３０倍ものレポータータンパク質発現を示すリボスイッチが得られた。さらに、アプタマー部分に変異を入れるなどして、リボスイッチが確かにヒスタミンに特異的に応答していることを確認した。また、一般的なS30無細胞翻訳系においてもリボスイッチの機能を確認した。
これらの実験により、極めて性能が高いヒスタミン応答性リボスイッチを得ることができた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の計画であるヒスタミン応答性リボスイッチの作成に成功した。リボスイッチの性能（最大３０倍の遺伝子発現活性化）としては当初の期待以上の値が得られた。

今後の研究の推進方策

開発に成功したリボスイッチをリポソーム内に封入し、その機能を確認する。また、リボスイッチにより様々なタンパク質の発現制御を行い、人工細胞の表現型を制御する。

次年度使用額が生じた理由

学会参加を見合わせたため、旅費を使用しなかったことと、リボスイッチの実験が予想よりも早く進行したため、PUREfrex試薬の消費が予定よりも少なかった。次年度には学会発表と、人工細胞実験およびリボスイッチの性能向上のための、高スループットスクリーニングのための消耗品を購入するために使用する予定である。