| 研究課題/領域番号 |
18KK0171
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
千葉 壮太郎 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (70754521)
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| 研究分担者 |
田中 利治 名古屋大学, 生命農学研究科, 特任教授 (30227152)
大井 崇生 名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (60752219)
佐藤 育男 名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (70743102)
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| 研究期間 (年度) |
2018-10-09 – 2022-03-31
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| キーワード | イネオレンジ葉ファイトプラズマ / 発生分布 / 拡散メカニズム |
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| 研究実績の概要 |
ファイトプラズマは農業上重要な絶対寄生病原菌のグループであり、人工的に培養できないため病原／伝播性機構について分子レベルで解明された例は殆どない。地球温暖化と気候変動による寒冷感受性昆虫の活動地域が広がるにつれて、ファイトプラズマに関連する病害が今後拡大すると考えられる。本研究では、イネオレンジ葉ファイトプラズマ（ROLP）の発生状況を把握するために、東南アジア諸国の広域に渡って調査を実施する。合わせて分子系統学的解析を行ない、ROLPの起源を初めて明らかにする。
初年度は、研究拠点と据えているカンボジアにおいて、ROLPの発生調査を進め、定期的に発病イネサンプルを採取し、飼育いした昆虫による病原伝搬試験を実施した。その結果、既報の媒介昆虫種に加えて、新規媒介昆虫種の同定に成功した。また、タイの協力研究者とROLPの発生調査を行ったが、確認されず、再度調査旅行を計画している。
また、全ファイトプラズマを検出可能なLAMP法を適用したところ、ROLPの検出が可能であった。カンボジア、フィリピン産ROLPの全ゲノム解析と、既報の中国株のゲノム情報を合わせて、ROLP特異的なLAMP検出法を開発し、今後、東南アジア諸国において圃場でのオンサイト発生調査に利用する予定である。
急速に感染拡大するROLPの伝搬能力について、その一端を明らかにするため、感染イネ組織におけるROLPの挙動を顕鏡的に調査した。DAPIによる蛍光染色法で師部組織特異的にROLPゲノムと思われる蛍光の集積を観察し、同組織をSEM・TEMにより詳細に調査する準備をしている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ROLPの全ゲノム解析、およびROLP感染植物の転写変動プロファイルの解析については、遅れているが、カンボジアにおけるROLP発生調査や保毒昆虫種の特定、伝搬試験実験系の確立と実施においては期待通りに進められている。また、ファイトプラズマのユニバーサルLAMPキットによるROLPの検出も確認でき、特異的LAMPプライマーの設計により、現地圃場における携行型LAMP装置を用いた発生調査も行えると考えており、周辺国での発生調査も今年度後期には開始できる。
既に、カンボジア、フィリピン、ベトナムにおけるPCRによるROLPの発生調査により、複数の遺伝子断片を取得しており、これらの配列解析によって分離株の遺伝的多様性を明らかにすることができる。媒介昆虫による伝搬試験の結果と合わせて、論文化が見込める状況にある。
植物体内におけるROLPの集積組織は、予想通り師部であることがDAPIによる蛍光染色法で示唆された。カンボジア拠点に配備した蛍光顕微鏡を用いて、植物全体の組織で同法によるROLPの集積とそのタイミングについて調査を進められる。さらに、電子顕微鏡での観察を加えて、詳細に植物体内でのROLPの挙動が明らかにされると期待できる。
以上から、研究全体の進捗としては、概ね順調だと判断される。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、フィリピン、カンボジアのROLP全ゲノムを決定し、中国株との比較に基づいて ROLPに特異的なLAMPプライマーを設計する。整備した携行型LAMP装置とこのプライマーを用いて、周辺東南アジア諸国でROLPの発生状況の実地調査を慣行する。本年度は、カンボジアでの予備試験を経てタイおよび台湾での発生調査を検討する。
また、研究拠点と定めているカンボジアにおいて、伝搬試験を繰り返し実施することで媒介生物がROLPを獲得するのに必要な時間を割り出す。次に、確実にROLPを獲得したと思われる媒介生物を用いて、SEM、TEMによる顕鏡的解析とddPCRにより、昆虫内のROLP挙動を明らかにする。
既に、一部のROLP感染イネでは他の植物ウイルスが共感染していることが報告されており、我々も同様にウイルスの共感染を検出した。これを詳細に解析するため、RNAseqによる共感染ウイルスの網羅的検出を行なう。また、共感染による病原性の強化あるいは干渉について調査する。さらに、同方法で非感染・感染植物の転写プロファイルを解析し、ROLP感染によって植物がどのように応答しているか調査する。情報を整理し、来年度には特定の遺伝子発現変動について、名大フィリピンキャンパスに導入したqPCR装置で定量的に解析し、確認実験を進める予定とする。
以上を通して、本年度の研究実施により、基本的情報を蓄積・整理し、纏まったものから論文発表していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ファイトプラズマROLPの全ゲノム情報を基に、特異的なLAMP検出システムを確立する予定であり、このシステムを利用してカンボジアおよび周辺国の病害発生調査を進める計画である。ただし、ROLPカンボジア株、フィリピン株のゲノム決定が未だ済んでいないために、全体的な進捗が後ろ倒しとなっている。また、顕鏡によるROLPの挙動解析においては、現在のところ蛍光顕微鏡を用いた解析に終止しており、植物および媒介昆虫の電子顕微鏡による解析に進んだ時点で、予算執行を行う予定である。
また、申請時に予定していたビーズ式組織細胞破砕装置・FastPrep-24 5G（クールユニット付）は、全体予算を鑑みて購入を断念した。本件も次年度使用額が生じた一因となっている。
予算執行は遅れているものの、研究全体としては決して大きく遅延している訳ではないため、前年度に執行されていないものは今年度に行ない、今年度に予定されている分については共同研究の実施に伴い粛々と執行していく予定である。
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