| 研究課題/領域番号 |
18KK0194
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
尾瀬 農之 北海道大学, 先端生命科学研究院, 准教授 (80380525)
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| 研究分担者 |
齋藤 徹 広島市立大学, 情報科学研究科, 講師 (80747494)
塚本 卓 北海道大学, 先端生命科学研究院, 助教 (30744271)
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| 研究期間 (年度) |
2019-02-07 – 2022-03-31
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| キーワード | 結晶回折 |
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| 研究実績の概要 |
中性子線結晶構造解析に供するため，ブロックポリマーを使用した結晶巨大成長法を引き続き開発し，アミド基転移酵素GatCABは再現的に結晶巨大化が可能になっている。その他，脱アミノ化酵素やプロテアーゼにも適用し，共に巨大結晶を作製することができた。得られた巨大結晶（200 x 200 x 800 um^ 3）をキャピラリー内にマウントして，茨城県生命構造解析装置(J-PARC)により中性子線照射，回折実験をおこなった。回折能は８オングストローム程度であったため，より高分解能化のため，更なる条件検討をおこなっている。GatCABに関しては，日本結晶学会２０２０年大会で一般発表，日本量子生命科学会において招待講演をおこなった。結晶成長法を幅広い対象に適用するため，示差走査型熱量計による解析を進めた。また，ブロックポリマーの官能基，重合度が及ぼす影響を調べるため，合成ポリマーの専門家である共同研究者，韓国浦項工科大学校のKim博士の研究室で合成された１５種の温度応答性ポリマーを使い，示差走査型熱量計・吸光度計による解析から結晶成長法を評価した。
引き続き，活性部位イミンにおける水素の挙動を中性子線・X線解析で理解するための膜蛋白質を精製し，結晶調製法および高分解能化の条件を検討中である。同時に、活性部位における水素の挙動が著しく変化する変異体の機能解析を完了し、論文投稿準備中である。また、類似する膜蛋白質の物性評価を継続しており，そのうち，硝酸イオンを特異的に輸送するイオンチャネル蛋白質の分子物性を学術論文誌に投稿した。
また，窒素に結合した水素の挙動を追跡するためには，QM/MM-MD法を適用した計算が必要となる。齋藤は複雑な化学反応を比較的安価にかつ高精度に記述できるQM/MM-MD法を提案し，DNAの酸化損傷のシミュレーションに適用した成果を学術論文誌に発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
中性子線回折測定のために，ミュンヘン工科大学の実験原子炉MLZ (FRM II)のビームタイム使用のための課題は採用されているが，新型コロナウイルス蔓延によりドイツに渡航できず，国内の中性子回折装置（J-PARC）における実験が，中性子測定実験である。そのため，ビームタイムが圧倒的に不足している。加えて，結晶格子が長いGatCAB（格子定数，74.6, 94.5, 182.5オングストローム）では解析用のデータセット収集が困難である。その間，他の蛋白質として，脱アミノ化酵素の発現・精製・結晶成長系の構築や，プロテアーゼの発現系，Ｘ線結晶構造解析，阻害剤との結晶化をおこなっている。脱アミノ化酵素に関しては，基質存在下で結晶化をおこなうと，生成物の状態で構造が得られ，アンモニアの窒素原子がＸ線結晶構造解析で確認できている。このため，同じ条件で結晶成長させ中性子線回折実験ができれば，アンモニアの水素原子の配向や蛋白質による認識状態が解析できるはずである。現在まで実験データをベースにした解析・議論ができなかったアンモニアが関与する酵素反応を解明すると共に，水素原子の量子性に関する議論を進めていく。
膜蛋白質に対して，開発中の結晶成長方法が適用可能かどうかを調べるため，高安定かつすでに結晶構造解析で実績のある光受容体タンパク質を用いて，調製系を最適化し，結晶成長の条件検討を引き続きおこなっている。
高精度な自由エネルギー曲面を効率的に得るための計算技術として，量子化学計算法AP-DFTによる量子古典混合分子動力学（QM/MM-MD）計算を新たに提案した。昨年度までに開発してきた高速計算手法rPM6と組み合わせた混合手法もすでに開発済みであり，定量的な予測が難しいとされている酸化還元反応などの酵素反応のシミュレーションも実施可能である。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究により，アミド基転移酵素GatCAB，脱アミノ化酵素，プロテアーゼは全て開発中の巨大結晶成長法によって結晶成長することが判明した（最大，一辺1.2 mm）。東海村J-PARCにある蛋白質中性子回折計で回折能の評価では回折能が少し足りないため，構造解析のためにはあと少し条件検討が必要である。脱アミノ化酵素では生成物としてのアンモニア存在下によって解析する。すでに，Ｘ線結晶構造からは，アンモニアの存在を突き止めている。中性子回折測定はクライオ条件によって測定することも考え得るため，研究室のX線回折計によって条件検討をおこなう。アミド基転移酵素GatCABは，コロナ禍が終了してミュンヘン工科大学MLZが使用できるようになれば，高分解能のデータ収集をおこなう。ドイツに滞在し実験できるようになれば，キャピラリー内で成長させた結晶の測定タイミングをX線と中性子で判断する。また，浦項工科大学にさらに長期滞在することにより，膜蛋白質も含め，系統立てて結晶成長理論の完成を目指す。
また，これまでに開発したシミュレーションの基盤技術を活用し，QM/MM-MD計算によるプロトン化状態の予測，酵素反応の機構解明に着手する。コロナ禍が終了してデュイスブルク-エッセン大学への長期滞在が可能となれば，開発手法を先方のプログラムに組み込み，スーパーコンピューターによる長時間のQM/MM-MD計算を実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍のため，海外渡航ができず，当初の研究計画が実行できないため。
次年度は，ドイツへの渡航が可能となり次第，ミュンヘン工科大学実験用原子炉FRMIIにより，GatCABグルタミン共結晶の高分解能回折測定のための渡航・滞在費用として使用する。また，ポリマー合成・評価の目的で韓国浦項工科大学校への渡航・滞在をおこなうために使用する。
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