病原性大腸菌等の細菌における膜環境の変化と連動した膜タンパク質形成機構の解明

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18KK0197
• 研究機関: 奈良先端科学技術大学院大学
• 研究代表者: 塚崎 智也 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (80436716)
• 研究分担者: 塩田 拓也 宮崎大学, キャリアマネジメント推進機構, 准教授 (20819304) ; 西山 賢一 岩手大学, 農学部, 教授 (80291334)
• 研究期間 (年度): 2018-10-09 – 2021-03-31
• キーワード: 膜タンパク質

研究実績の概要

本研究では病原性大腸菌等の細菌の膜タンパク質形成過程を解明すべく研究を進めている。大腸菌内膜へのタンパク質膜挿入には糖脂質MPIaseと膜タンパク質YidCが重要な役割を担う。MPIaseの解析においては，無秩序な自発的膜挿入を完全に排除したタンパク質膜挿入反応の再構成系を確立し，膜挿入には糖脂質MPIaseが必須でYidCタンパク質は膜挿入反応を加速することを明らかにした。YidCの解析においては，前年度に報告したYidCの高分解能構造解析と過去のYidCの構造解析とを比較し詳細な考察を行い，総説として発表した。また，YidCの分子メカニズムをより詳細と明らかとすべく基質タンパク質やMPIaseとの共結晶化を試みた。
グラム陰性菌の外膜の形成機構、特に外膜に存在する様々な役割を持つ多種多様な「外膜タンパク質」の正しい立体構造形成を伴った膜組込み「アセンブリー」について解析してきた。アセンブリーは外膜に存在するBAM複合体等の分子装置により行われる。塩田らは、アセンブリー解析のためのin vitro再構築実験としてEMMアセンブリーアッセイを開発した。これまでEMMアセンブリーアッセイを改変したスクリーニング系を開発し、BAM複合体に対する阻害ペプチドを４種類単離することに成功した。また、阻害ペプチドに含まれている配列を解析することにより、βバレル型膜タンパク質の構造上に高度に保存されているプロリン残基とタイロシン残基があり、これがアセンブリーに必須であることを突き止めた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

おおむね順調に研究が進行した結果，国際的に原著論文，レビュー論文，解説記事を発表した。

今後の研究の推進方策

生体膜には多くの膜タンパク質が存在し，様々な役割を果たしている。新規に合成された膜タンパク質は膜へと組み込まれアッセンブリーをするなどして機能的な複合体を形成するが，その過程の詳細は不明である。大腸菌などの膜タンパク質の膜組み込みやアッセンブリーには，膜タンパク質SecYEG, SecDF, YidC, BAM複合体や糖脂質MPIaseなどが複雑に連携すると考えられている。BAM複合体は外膜タンパク質の形成，それ以外は内膜タンパク質の形成に関わる。これらの分子メカニズムには未だ不明な点が多く，今後も継続してさらなる解析を続ける。構造解析ではSecYEG, YidC, SecDF, MPIase, BAM複合体を含む2者，3者複合体の構造をX線結晶構造解析で明らかとすべく研究を進める。同時に，基質との構造解析を進める。取得した構造情報に基づく分子メカニズムの解明には生物物理学的な手法やコンピューターシミュレーションによる解析を新たな国際共同研究で進める。また，特にMPIaseの解析において，MPIaseとYidCとの機能的な連携を詳細に調べるため，MPIaseの化学修飾体や部分合成標品を用い、YidC変異体がタンパク質の膜挿入活性に及ぼす影響を再構成系で評価する。さらに、YidCやSecYEGにタグを付加し、MPIaseが共精製されるかどうか調べ、これらの直接的な相互作用を示す。また，BAM複合体の動的な分子メカニズムの解明のため，シグナル認識時のBAM複合体の立体構造を中性子反射率法をもちいて評価する。中性子反射率法はJ-Parcにて実施し、国際共同研究者のShen研究室からスタッフを派遣してもらい解析を進める。さらに、生化学的手法および、部位特異的光架橋法をもちいて、シグナルを認識するBAM複合体のサブユニットと部位を決定する。これらの解析を通して、膜タンパク質のアセンブリーの分子機構の解明と膜形成機構の解明を目指す。

次年度使用額が生じた理由

国際的な活動が新型コロナウイルスのため一部研究活動が制限され，実験が計画通り進まなかったため。

研究成果

• [国際共同研究] モナシュ大学 Shen研究室/モナシュ大学 Lithgow研究室(オーストリア)
  • 国名: オーストリア
  • 外国機関名: モナシュ大学 Shen研究室/モナシュ大学 Lithgow研究室
• [雑誌論文] Biosynthesis of glycolipid MPIase (membrane protein integrase) is independent of the genes for ECA (enterobacterial common antigen) (2020)
  • 著者名/発表者名: Kamemoto Yuki、Funaba Nanaka、Kawakami Mayu、Sawasato Katsuhiro、Kanno Kotoka、Suzuki Sonomi、Nishikawa Hanako、Sato Ryo、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: The Journal of General and Applied Microbiology 巻: 66 ページ: 169～174
  • DOI: 10.2323/jgam.2019.05.001
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 大腸菌におけるタンパク質膜輸送に関与する糖脂質MPIase の発現制御機構~酵素様機能をもつ糖脂質 MPIase~ (2020)
  • 著者名/発表者名: 沢里克宏, 藤川紘樹, 島本啓子, 西山賢一
  • 雑誌名: 化学と生物 巻: 58 ページ: 223～230
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of the mitochondrial import gate reveals distinct preprotein paths (2019)
  • 著者名/発表者名: Araiso Yuhei, Tsutsumi Akihisa, Qiu Jian, Imai Kenichiro, Shiota Takuya, Song Jiyao, Lindau Caroline, Wenz Lena-Sophie, Sakaue Haruka, Yunoki Kaori, Kawano Shin, Suzuki Junko, Wischnewski Marilena, Schutze Conny, Ariyama Hirotaka, Ando Toshio, Becker Thomas, Lithgow Trevor, Wiedemann Nils, Pfanner Nikolaus, 他２人
  • 雑誌名: Nature 巻: 575 ページ: 395～401
  • DOI: 10.1038/s41586-019-1680-7
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Structural Basis of Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase 2b Regulation via Transmembrane Helix Interplay (2019)
  • 著者名/発表者名: Inoue Michio、Sakuta Nanami、Watanabe Satoshi、Zhang Yuxia、Yoshikaie Kunihito、Tanaka Yoshiki、Ushioda Ryo、Kato Yukinari、Takagi Junichi、Tsukazaki Tomoya、Nagata Kazuhiro、Inaba Kenji
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 27 ページ: 1221～1230
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2019.03.106
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structural Basis of the Sec Translocon and YidC Revealed Through X-ray Crystallography (2019)
  • 著者名/発表者名: Tsukazaki Tomoya
  • 雑誌名: The Protein Journal 巻: 38 ページ: 249～261
  • DOI: doi.org/10.1007/s10930-019-09830-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A snapshot of membrane protein insertion (2019)
  • 著者名/発表者名: Tanaka Yoshiki、Tsukazaki Tomoya
  • 雑誌名: EMBO reports 巻: 20 ページ: e49034
  • DOI: doi.org/10.15252/embr.201949034
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The bacterial protein YidC accelerates MPIase-dependent integration of membrane proteins (2019)
  • 著者名/発表者名: Sasaki Masaru、Nishikawa Hanako、Suzuki Sonomi、Moser Michael、Huber Maria、Sawasato Katsuhiro、Matsubayashi Hideaki T.、Kumazaki Kaoru、Tsukazaki Tomoya、Kuruma Yutetsu、Nureki Osamu、Ueda Takuya、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 294 ページ: 18898～18908
  • DOI: 10.1074/jbc.RA119.011248
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Real-time observation of membrane protein-embedded nanodiscs by high-speed atomic force microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Takamitsu Haruyama, Tomoya Tsukazaki
  • 雑誌名: 野口研究所時報 巻: 62 ページ: 42～49
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] Novel Glycolipid Involved in Membrane Protein Integration: Structure and Mode of Action (2019)
  • 著者名/発表者名: Fujikawa Kohki、Nomura Kaoru、Nishiyama Ken-ichi、Shimamoto Keiko
  • 雑誌名: Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japan 巻: 77 ページ: 1096～1105
  • DOI: 10.5059/yukigoseikyokaishi.77.1096
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Enzyme-like Glycolipids MPIase Involved in Membrane Protein Integration of E. coli (2019)
  • 著者名/発表者名: Fujikawa Kohki、Nishiyama Ken-ichi、Shimamoto Keiko
  • 雑誌名: Trends in Glycoscience and Glycotechnology 巻: 31 ページ: E151～E158
  • DOI: 10.4052/tigg.1705.1E
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Free energy profiles of lipid translocation across pure POPC and POPC/CHOL bilayer: all-atom molecular dynamics study (2019)
  • 著者名/発表者名: Saito Hiroaki、Morishita Tetsuya、Mizukami Taku、Nishiyama Ken-ichi、Kawaguchi Kazutomo、Nagao Hidemi
  • 雑誌名: Journal of Physics: Conference Series 巻: 1290 ページ: 012020～012020
  • DOI: 10.1088/1742-6596/1290/1/012020
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Alteration of Membrane Physicochemical Properties by Two Factors for Membrane Protein Integration (2019)
  • 著者名/発表者名: Nomura Kaoru、Yamaguchi Toshiyuki、Mori Shoko、Fujikawa Kohki、Nishiyama Ken-ichi、Shimanouchi Toshinori、Tanimoto Yasushi、Morigaki Kenichi、Shimamoto Keiko
  • 雑誌名: Biophysical Journal 巻: 117 ページ: 99～110
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2019.05.014
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Two‐step induction of cdsA promoters leads to upregulation of the glycolipid MPIase at cold temperature (2019)
  • 著者名/発表者名: Sawasato Katsuhiro、Sekiya Yusei、Nishiyama Ken‐ichi
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: 593 ページ: 1711～1723
  • DOI: 10.1002/1873-3468.13460
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Expression of alcohol oxidase gene from Ochrobactrum sp. AIU 033 in recombinant Escherichia coli through the twin-arginine translocation pathway (2019)
  • 著者名/発表者名: Matsumura Kenji、Yamada Miwa、Yamashita Takeshi、Muto Hitomi、Nishiyama Ken-ichi、Shimoi Hitoshi、Isobe Kimiyasu
  • 雑誌名: Journal of Bioscience and Bioengineering 巻: 128 ページ: 13～21
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2018.12.012
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Increased expression of the bacterial glycolipid MPIase is required for efficient protein translocation across membranes in cold conditions (2019)
  • 著者名/発表者名: Sawasato Katsuhiro、Suzuki Sonomi、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 294 ページ: 8403～8411
  • DOI: 10.1074/jbc.RA119.008457
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] YnbB is a CdsA paralogue dedicated to biosynthesis of glycolipid MPIase involved in membrane protein integration (2019)
  • 著者名/発表者名: Sato Ryo、Sawasato Katsuhiro、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 510 ページ: 636～642
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.01.145
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] CdsA is involved in biosynthesis of glycolipid MPIase essential for membrane protein integration in vivo (2019)
  • 著者名/発表者名: Sawasato Katsuhiro、Sato Ryo、Nishikawa Hanako、Iimura Naoki、Kamemoto Yuki、Fujikawa Kohki、Yamaguchi Toshiyuki、Kuruma Yutetsu、Tamura Yasushi、Endo Toshiya、Ueda Takuya、Shimamoto Keiko、Nishiyama Ken-ichi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: 1372
  • DOI: 10.1038/s41598-018-37809-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] バクテリア外膜タンパク質アセンブリー解析の新手法「EMMアセンブリーアッセイ」 (2020)
  • 著者名/発表者名: 塩田拓也
  • 学会等名: 第93回 日本細菌学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] タンパク質膜挿入・膜透過反応に関与する「糖脂質酵素(Glycolipozyme)」MPIaseの構造と機能 (2020)
  • 著者名/発表者名: 西山賢一
  • 学会等名: 新潟薬科大学学術講演会
  • 招待講演
• [学会発表] 大腸菌のタンパク質膜挿入・膜透過にかかわる糖脂質MPIaseの構造と機能 (2020)
  • 著者名/発表者名: 西山賢一
  • 学会等名: 遺伝研研究会「単細胞システムにおける細胞内装置の動的相互作用」
  • 招待講演
• [学会発表] 硫黄トランスポーターの結晶構造解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 塚崎智也
  • 学会等名: 第16回21世紀大腸菌研究会
• [学会発表] タンパク質膜透過チャネルSecトランスロコンを経由するタンパク質輸送のメカニズム (2019)
  • 著者名/発表者名: 塚崎智也
  • 学会等名: 岩手大学放射光利用セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] 大腸菌外膜βバレル型膜タンパク質輸送阻害ペプチドの探索 (2019)
  • 著者名/発表者名: 塩田拓也
  • 学会等名: 第16回21世紀大腸菌研究会
• [図書] 膜タンパク質工学ハンドブック (2020)
  • 著者名/発表者名: 監修 津本浩平・浜窪隆雄
  • 総ページ数: 538(307-315)
  • 出版者: エヌ・ティー・エス
• [備考] ミトコンドリアへのタンパク質搬入口TOM複合体の精密構造と働く仕組みを解明
  • URL: https://www.kyoto-su.ac.jp/news/20191015_345_ki01.html
• [備考] タンパク質膜挿入反応に必要な糖脂質 MPIase の生合成遺伝子を発見
  • URL: https://www.iwate-u.ac.jp/upload/images/0204pressrelease.pdf