| 研究課題/領域番号 |
18KK0229
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
齊藤 達哉 大阪大学, 薬学研究科, 教授 (60456936)
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| 研究分担者 |
小迫 英尊 徳島大学, 先端酵素学研究所(オープンイノベ), 教授 (10291171)
乙田 敏城 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 特任助教 (60719946)
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| 研究期間 (年度) |
2018-10-09 – 2021-03-31
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| キーワード | 免疫 / 炎症 / 生理活性脂質 / 細菌感染 |
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| 研究実績の概要 |
リポ多糖に応じて活性化する自然免疫機構であるNon-canonicalインフラマソームを介した炎症応答は、細菌を排除する役割を果たす一方で、過度に誘導されてエンドトキシンショックを引き起こす負の側面も有している。本研究では以下（１－２）の解析を行い、当該機構について分子から生体に至る幅広い観点から理解を深め、当該機構を標的とする治療法の開発に資する基盤的研究を推進する。（１）生理活性脂質がNon-canonicalインフラマソームを抑制する機序を分子レベルで解明する。続いて、（２）当該脂質の産生に関わる刺激・細胞を同定し、生体レベルにおいて炎症応答を抑制する機序を解明する。研究代表者は分子が駆動する細胞応答の解析を、そして海外共同研究者は細胞が織り成す生体応答の解析を主に担当する。H30年度は（１）に関する研究を集中して推進し、Non-canonicalインフラマソームの活性化を抑制する生理活性脂質として同定した15d-PGJ2について、ビオチン修飾された15d-PGJ2を用いてマウスマクロファージの細胞溶解液から結合因子を精製し、質量分析により同定した。また、マウスマクロファージの細胞溶解液中において、同定した因子とビオチン15d-PGJ2が結合することをウエスタンブロッティングにより再確認した。さらに、一部の因子については、リコンビナントタンパク質とビオチン15d-PGJ2を用いて、両者が直接的に結合することを確認した。一連の解析により、次年度以降に解析対象とする15d-PGJ2の標的因子候補を選出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り、15d-PGJ2と結合する因子を包括的に同定することに成功した。結合因子の中には、Non-canonicalインフラマソームの活性化に関わることが報告されている因子も複数含まれていた。
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| 今後の研究の推進方策 |
【プロジェクト（１）：生理活性脂質によるNon-canonicalインフラマソームの抑制機序の解明】生理活性脂質15d-PGJ2が、どのような分子に作用し、どのような機序でNon-canonicalインフラマソームを抑制するのかを解明する。(A) biotin-15d-PGJ2結合因子のデータを基に、15d-PGJ2が作用する因子を探索する。J774マウスマクロファージ株において標的候補因子をCas9/CRISPR技術により欠損させて、IL-1放出などを指標にNon-canonicalインフラマソーム制御への関与を検証し 、真の標的因子を決定する。(B) 15d-PGJ2標的因子が、Caspase-11、GSDMDなどのNon-canonicalインフラマソーム活性化に関わる因子と結合するか否かを検証する。本プロジェクトは、研究代表者、研究分担者を中心とする日本の研究者が行う。
【プロジェクト（２）：Non-canonicalインフラマソームを抑制する生理活性脂質の産生機序の解明】15d-PGJ2の産生に関わる刺激・細胞を同定し、生体レベルにおいて炎症応答を抑制する機序を解明する。C57BL/6マウスの腹腔、血液、肝臓などの臓器から血球系細胞を回収し、細胞集団ごとに振り分ける。LPSに加えて、LPSによって上昇するサイトカインや 抗原受容体刺激抗体などを細胞集団の性質に合わせて用いて、どの細胞集団が、どのような刺激に応じて15d-PGJ2を産生するのかを解明する。本プロジェクトを推進するため、H31年度に研究代表者と研究協力者が、海外共同研究者である王静博士の研究室（上海交通大学）を訪問する。免疫細胞集団の単離や可視化について共同研究を行い、さらに実験手技を会得する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【次年度使用額が生じた理由】biotin-15d-PGJ2に結合する因子を精製し、質量分析により同定する実験は、実験条件の最適化のために複数回行う見込みであった。しかしながら、一度目の実験でNon-canonicalインフラマソームの活性化に関わるとされる因子が複数ヒットし、信頼性の高い結果が得られたため、当該同定実験にかかる費用が当初予定よりも少なくなった。
【次年度使用計画】15d-PGJ2に結合するものとして同定した因子はファミリーを形成し、複数の因子が相補的に働きながらNon-canonicalインフラマソームの活性化に関わると考えられている。当初予定では15d-PGJ2の標的因子は1つとして解析費用を見積もっていたため、複数の因子を解析するためには当初予定を超える解析費用が必要となる。次年度に持ち越した研究費は当該解析の費用に充当する。
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