研究課題
1分子シーケンシングは、低コストでハイスループットな生命システム解析を可能にする技術の一つである。そこで本研究では、人工塩基対を用いたDNAの位置特異的修飾法を応用することによって、1分子シーケシシングに適したDNA断片をmRNAから簡便に調製する方法を試みた。シュードウリジンを原料として、N1位に置換基を有するシュードシチジン三リン酸を合成しポリメラーゼ反応に於ける基質特性を評価したが、連続配列への取り込みは確認されなかった。次に、DNA配列決定における読取り可能塩基数の拡張やピロリン酸検出の際のS/N比の向上などを指向して、パイロシーケンシング法に適用可能な新たな核酸基質アナログの開発を行った。パイロシーケンシング法は、1分子シーケンシングへの応用で脚光を浴びているDNA配列決定法であるが、ルシフェラーゼ反応への干渉を避けるために、ポリメラーゼ反応の基質としてデオキシアデノシン三リン酸(dATP)の代わりに、デオキシアデノシンα-チオ三リン酸(dATPαS)およびその誘導体を使用している。しかし、dATPの代わりにdATPαSなどを用いる手法は、海外の先行特許に抵触する他、ポリメラーゼ反応によってS-オリゴ(硫黄含有オリゴDNA)を生じるため、反応効率の低減などが欠点として挙げられている。そこで置換基を有する種々の核酸基質アナログを合成し、それらのパイロシーケンシング法における基質特性を精査したところ、バックグラウンド・ノイズを著しく低減させるアナログの開発に成功した。
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