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特定のリン酸化チロシン配列を蛍光により計測するセンサーの構築
RNPペプチド複合体(リボヌクレオペプチド)を用いたテーラーメイドリセプター作製法により、EBNA2コアクチベーターの二箇所のリン酸化されるチロシン(pTyr)、Gly-pTyr-Ser-Arg部位を標的とし、周辺アミノ酸配列に特異的なチロシンリン酸化に対するテーラーメイドRNPリセプターを作製した。得られたRNPはリン酸化チロシンとチロシンまたはリン酸化セリンを識別するだけでなく、Gly-pTyr-Ser-Arg部位とGlu-pTyr-Gly-Met部位とを識別可能であった。フルオレセイン、7-メチルクマリン、ピレン等の蛍光分子をN末端に導入したペプチドを合成し、得られたリボヌクレオペプチド・テーラーメイドリセプターのRNAサブユニットと複合体を形成させて、光応答性リセプタープール(fluorescent RNP Pools)を作製した。蛍光測定によって、光応答性リセプタープールから、Gly-pTyr-Ser-Arg配列のリン酸化チロシンに対して最も効率よく応答するフルオレセインを有する蛍光性センサーを選出した。このセンサーは周辺アミノ酸配列を535nmの蛍光により識別可能であり、解離定数は4μMであった。
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