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自然免疫は病原体が特有にもう分子パターンを認識し、獲得免疫に先駆けて誘導される免疫機構であり、そのシグナル伝達機構の解明は疾患の治療にも役立つと考えられる。本研究の目的はウイルス由来二重鎖RNAを認識し自然免疫を誘導する因子であるRIG-I、MDA-5についてNMR、X線結晶構造解析により立体構造を決定し、ウイルスRNAに対する特異的な認識機構を解明する事である。
1.RIG-I、MDA5について、バキュロ発現系を用いて全長のタンパク質を発現した。RIG-Iについてぱ結晶化に十分なタンパク質を精製することが出来た。
2.全長のRIG-Iの結晶化を自由界面拡散法を用いて行った。微小結晶を得たので、X線結晶構造解析に耐えうる結晶を得るため、結晶化条件の検討を行っている。
3.全長のMDA5を用いて、プロテアーゼ限定分解を行い、ドメインの切り出しを行った。RIG-I同様、MDA5もC末端側に安定なドメイン構造を持つことを確認した。
4.限定分解、バイオインフォーマティックス情報により、MDA5のC末端ドメインの構造ドメインを同定し、各ドメインを大腸菌を用いて発現し、NMRによる構造解析を行なった。
5.構造解析の結果に基づいて、ドメインの二重鎖RNA認識機構を検討し、ウィルスセンサーとしてのRIG-I、MDA5の挙動を解析した結果、それぞれウィルス特有のRNA構造を認識することがわかった。
6.構造解析の結果に基づき、MDA5の変異体を調製した。今後プルダウンアッセイ、超遠心分析、MSスペクトル、円偏光二色性分光計を用いてのin vitro機能解析を進める。
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