| 研究概要 |
我々は、タバコ細胞抽出液(BYL)を用いた試験管内トマトモザイクウイルス(ToMV)RNA翻訳・複製系を確立した。生体膜を除去したBYLでToMV RNAを翻訳すると、ウイルスがコードする130K,180K複製タンパク質とゲノムRNAを含む、沈降係数約70Sの複合体(pre-membrane-targeting complex:PMTC)が形成され、これが膜結合複製複合体の前駆体となっていることを明らかにした。本研究は、PMTCを精製し、含まれる宿主因子を同定し、それらの因子がPMTCあるいは複製複合体形成過程において果たす役割を解明することを目的とする。180Kタンパク質のC末端にタグをもつToMV誘導体RNAを、生体膜除去BYLで翻訳し、PMTCの精製を試みたが、共精製されたタンパク質の同定を行うのに十分な量を確保することが困難であった。収量が低い原因のひとつとして、180Kタンパク質が130Kタンパク質のリードスルー産物であり、少量しか合成されないことが考えられた。PMTCの形成過程では、先ず130Kタンパク質が翻訳に共役してゲノムRNAに結合し(core PMTC)、これに引き続き180Kタンパク質が翻訳とは独立して結合することによりPMTCを形成することがわかっている。そこで、130Kタンパク質のC末端にタグをもつToMV誘導体RNAを、生体膜除去BYLで翻訳し、core PMTCを精製した。さらに、共精製されたタンパク質をSDS-PAGEにより分離後、LC-MS/MS法により同定した。現在同定された因子をコードする遺伝子がアグロバクテリウムのTransfer-DNAの挿入により不活化されたシロイヌナズナにおけるToMVの増殖の可否を調べている。
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