| 研究概要 |
モデル膜蛋白質系として、古細菌フォボロドプシンの信号伝達タンパクであるpHtrIIど、7回膜貫通蛋白質であるハロロドプシンを主に取り上げた。これらは、大腸菌の量発現系により最小倍地を用いて^<13>C,^<15>N同位体標識をおこなった。蛋白質は^2H化した脂質二重膜に再構成して機能があることを確かめて、固体高分解能NMRによる構造解析の対象とした。室温では、膜外領域など運動性の高い領域と膜貫通領域など運動性の低い領域を分離して測定する方法を開発した。水溶性領域の観測はJ結合によるINEPT法による方法で、貫通領域は双極子結合によるCP法による方法を用いた。水溶性領域については特に高い分解能でNMRシグナルを測定することができた。これを、主に大きいJ結合を用いた多次元^1H,^<13>C,^<15>N多重共鳴NMR法で、信号を分離して測定した。H-C2次元、H-CC2次元、HN-C2次元分解法などにより多数の残基内相関を得て、ほぼアミノ酸残基に信号を帰属することができた。解析が進んだのはpHTrIIであった。化学シフトに基づいて、水溶性領域はαヘリックスを主に取っていることがわかった。これは、このpHtrIIによる長い距離での信号伝達には必要な構造要素であると考えられた。さらに残基間相関を得るために^1H-^1H双極子結合を使う方法、^<15>N-^<13>Cの弱いJ結合を用いる方法、部位特異的スピンラベル法(SDSL)の検討を開始した。^1H-^1H NOE法では分子鎖が強固な構造を作っていないため強い分子間相関を得られていない。N-C_J結合法では、脂質二重膜にある分子であるため緩和が早く弱いJ結合による相関が観測できてない。そこで重水素化法、SDSL法、アミノ酸選択的標識法を検討して残基間相関の測定を試みている。
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