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約1日周期の生物リズムを生み出す概日時計は、一群の時計遺伝子の転写・翻訳を介したフィードバクループにより形成されている。そのため、多くの時計遺伝子の転写は時刻依存的に制御され、その翻訳産物である時計タンパク質は約24時間周期で増減を繰り返す。我々は、このリズミックな転写において、強力な負の制御因子であるCRY2が時刻依存的に「複数のタンパク質キナーゼによる多段階リン酸化」を受け、プロテアソーム系によって分解されることを世界に先駆けて報告した。本年度は、CRY2の多段階リン酸化の引き金を引くプライミングキナーゼを同定することができた。このキナーゼをノックダウンすると、CRY2 Ser557のリン酸化レベルが
減弱し、さらにCRY2のタンパク質量が増加した。さらに、このキナーゼのSer557リン酸化活性が大きく日周変動することを見出した。これらの実験結果から同定したキナーゼは、時計細胞においてCRY2のタンパク質量を時刻依存的に制御する重要な因子であると考えられた。このCRY2のリン酸化とタンパク質分解は、主に時計細胞の細胞質において起こるイベントであることを見出した。
一方、申請者らは、分子時計の正の制御因子であるCLOCKが時刻依存的にリン酸化されること、さらにこのリン酸化がCLOCKをプロテアソームを介した分解に導く可能性を見出した。本年度は、より直接的な解析を目指してCLOCKリン酸化部位の同定を試みた。具体的には、マウス肝臓の核画分を出発材料に、DEAEカラムおよび抗CLOCKモノクローナル抗体固定化カラムを用いてCLOCK-BMAL1複合体を精製した。こうして得た肝臓のCLOCKを質量分析に供して数多くのリン酸化部位を同定した。現在、これら複数のリン酸化部位のそれぞれの生理的役割を明らかにすべく、変異導入を中心に分子解析を進めている。
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