| 研究課題/領域番号 |
19206085
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
山田 秀徳 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 教授 (80037613)
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| 研究分担者 |
二見 淳一郎 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 准教授 (00420498)
妹尾 昌治 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 教授 (90243493)
多田 宏子 岡山大学, 自然生命科学研究支援センター, 准教授 (60271061)
小坂 惠 岡山大学, 自然生命科学研究支援センター, 助手 (00170233)
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| キーワード | タンパク質 / 化学修飾 / 結晶化 / 格子工学 / 細胞内導入 / フオルデイング / タンパク質工学 / バィオテクナロジー |
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| 研究概要 |
(1) in cellフォルディング法の確立と人工タンパク質生産技術への応用
変性タンパク質のシステイン残基にジスルフィド結合を介して正電荷を導入する可逆的変性カチオン化法を最適化するため、3つの4級アンモニウム基と1つのメタンチオスルフォナート基を有する新規カチオン化試薬:TAP3S-Sulfonateを合成し、各種の変性タンパク質の可溶化能を評価した。その結果、本試薬は疎水性の高い難溶性タンパク質の可溶化に大きく寄与すること、反応後に副生成物などをHPLC等で除去する高度精製を行えば、凍結乾燥後にも水で容易に再溶解できることなどを見出し、本技術の汎用性がより向上した。また、平成20年度に開発済みのGST融合タンパク質の細胞内導入技術(J. Biochem. (2008)144, 447)をモデルとして、エンドサイトーシス様の経路で細胞内に移行したGST融合タンパク質を細胞質中へ効率的に放出させるための添加剤や添加手順の条件検討を行い、試験管内の繊維芽細胞ではほぼ100%の高効率でGST融合タンパク質を細胞質内まで高効率に送達可能なプロトコールを完成した。さらにこれらの新規カチオン化試薬と細胞質内までの高効率な導入プロトコールを組み合わせて、試験管内では活性構造へのフォルディングや翻訳後修飾が困難なタンパク質をモデルとして細胞内導入実験を行い、従来法では困難であったタンパク質も、in cellフォルディング経路で成熟化が可能なことを示唆する基礎データが得られた。
(2) 結晶化タグを用いた結晶分子配向性制御
分子表面の相互作用部位に2-3個の疎水性のロイシンを配置させた結晶化のパッキングサイト(結晶化タグ)のデザインには既に成功しているが、今年度は、PDBに登録されている構造からロイシン以外の結晶化タグの有効性について検証した。難結晶化タンパク質をモデルとした結晶化実験は現時点では成功しておらず、ロイシンを用いた結晶化タグの優位性が確認された。
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