| 研究課題/領域番号 |
19209020
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
甲斐 雅亮 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (00160953)
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| 研究分担者 |
椛島 力 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 准教授 (20274673)
柴田 孝之 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教 (10448491)
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| キーワード | 感染症 / プリオン / 蛋白質 / 核酸 / アプタマー / マイクロアレイ / 発光検出 |
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| 研究概要 |
クロイツフェルト・ヤコブ病や牛海綿状脳症(狂牛病)の原因である異常型プリオンタンパク質の新検査法開発研究において、異常型プリオンタンパク質に特異的に結合するアプタマー核酸を創製する必要がある。そのために、本年度では、プリオンタンパク質(PrP)とRNAプールの作製を試みた。
まず、マウスPrPを得るために、PrP遺伝子のクローニングと大腸菌での発現を検討した。マウス脳cDNAライブラリーのPCRによりPrP遺伝子を増幅し、発現用ベクターに組み込んだ後、大腸菌を形質転換した。このとき、発現タンパク質の精製を容易にするために、PrPは、マルトース結合タンパク質(MBP)と融合したタンパク質(MBP-PrP)として発現させることにした。その結果、PrP遺伝子を組み込んだ大腸菌において、MBP-PrPと推定されるタンパク質が発現した。この形質転換体を用いて、アミロースレジンによるアフィニティ-カラムクロマトグラフィーにより精製を行なったところ、ほぼ単一にMBP-PrPを精製することができた。また、N末端側より72残基、162残基を欠損させたPrPも遺伝子組み換えにより調製し、72残基欠損したPrPに関しては同様に精製も行なった。次に、4^<25>種類のDNAからなるDNAプールを合成し、PCRとRNAポリメラーゼ反応によってRNAプールを作製した。また、このRNAプールを用いて、アプタマーのスクリーニングを行うために、PVDF膜にPrPをスポットした後、その膜をRNAプールに浸し、PrPと親和性が低いRNAを洗浄操作で除去する簡便なスクリーニング手法を開発するにあたり、結合反応と洗浄条件の検討を行なった。その結果、結合反応にはPBSを、洗浄にはTriton X-100が有効であることが分かった。
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