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本研究では、ゲノムプロジェクトで得られた塩基配列情報を網羅的な遺伝子機能解析へ利用するために、遺伝子の両アレルを破壊したマウスES細胞バンクを構築する。具体的には、遺伝子トラップ型ベクターで遺伝子の片アレルを破壊したのちに、テトラサイクリンシステムを用いてBloom遺伝子の発現を一時的に抑制して両アレル変異体を誘導し、それを単離してバンク化する。これにより、変異体解析の律速段階である「両アレル変異体の単離」をhigh-throughput化できると考えられる。近年はES細胞を様々な細胞系譜へ分化させる研究が盛んに行われている。よって、両アレルに変異を有すES細胞があれば、様々な細胞系譜へ分化させることにより、培養細胞レベルでの表現型解析を加速化できると考えられる。
本年度は、バンクの構築をhigh-throughput化するための実験条件を確立した。
1.遺伝子トラップ型レトロウイルスベクターの開発
両アレル変異体の単離を、薬剤耐性遺伝子を用いて効率良く行なうため、新たなベクターを開発した。
2.片アレル変異ES細胞バンクの作製
レトロウイルスベクターのES細胞へ感染、G418耐性株の単離、細胞の凍結保存とDNA精製、レトロウイルスベクターのゲノムへの挿入部位の決定、という一連の操作をhigh-throughput化するプロトコールを確立した。このプロトコールを元にして、大規模なバンクの作製を開始した。
3.両アレル変異ES細胞の単離条件の確立
1の新型ベクターの特性である薬剤選択法を至適化し、両アレル変異ES細胞単離のプロトコールを確立した。
4.変異遺伝子のデータベースの作製
ベクター挿入部位の配列を、インターネットのbrowser形式でデータベース化した。
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