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哺乳動物細胞における遺伝子機能解析を迅速化させるために、遺伝子の両アレルを破壊したマウスES細胞バンクを構築した。
(1)変異導入用ベクターの構築
表現型と変異遺伝子の対応を明確にするために、トランスポゾンを変異原に用いたベクターを構築した。トランスポゾンベクターは、従来用いていたレトロウイルスベクターとは異なり、トランスポゼースを発現させることにより、ベクターのほぼ全領域をゲノムから除去することができる。その結果として表現型が消失すれば、ベクター挿入部位の遺伝子が表現型の原因であることを証明できる。実際に、トランスポゼースによるベクターの除去を実証できた。
(2)ヘテロ変異体ES細胞バンクの作製
上記の改変型ベクターをBloom遺伝子改変ES細胞へ導入し、Hyg/G418での薬剤選択後、耐性株を96-well plateへ単離した。薬剤耐性株の凍結保存とDNA精製を行い、ベクターのゲノムへの挿入部位を決定した。さらに、ベクター挿入部位の配列を、マウスゲノムデータベースに対して検索し、変異遺伝子のデータベースを構築した。
(3)ホモ変異体の単離と表現型解析
上記のデータベースから、遺伝子機能が未知の遺伝子を選定し、ヘテロ細胞株を解凍した。ドキシサイクリン存在下で培養してBloom遺伝子の発現を抑制し、前年度までに開発したプロトコールを用いて、ホモ変異体を単離した。さらに、ES細胞の分化誘導系を用いて、培養細胞レベルで、表現型を解析した。
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