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損傷乗り越え複製における複製型DNAポリメラーゼと損傷乗り越えDNAポリメラーゼとのスィッチングや損傷乗り越えポリメラーゼ間の使い分けなどは関連タンパク質の翻訳後修飾により制御されていると考えられているが、その分子メカニズムや生理的意義は明らかではない。本研究において本年度は、DNA複製のスライディングクランプであるPCNAのモノユビキチン化及び主要な損傷乗り越えDNAポリメラーゼであるPolηの翻訳後修飾について解析するための系を構築した。具体的には、細胞内でのPCNAのモノユビキチン化が紫外線照射や複製ストレスにより誘発されることを明らかにした。また内在性PCNAを外来性の変異PCNAに置換する実験系を構築した。さらに試験管内で、DNA複製反応および紫外線DNA損傷に応答してPCRAのモノユビキチン化反応を行う系を構築し、そのユビキチン化に必要なタンパク質因子群の同定に着手し、PCNAのモノユビキチン化を制御しうる因子群を同定しつつある。一方、Polηについては、HA-Ubとの共発現系を構築し、ヒト細胞内でユビキチン化されていることを検出することに成功した。さらに、等電点電気泳動などによる解析から、Polηがヒト細胞内でリン酸化修飾を受けていることを新たに見出した。これらの翻訳後修飾部位を同定し、その生理的意義を解明するために、翻訳後修飾を受けたタンパク質の大量精製のための準備を進めるなど、計画を遂行している。
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