研究課題
脱窒菌などは脱窒と共役して生体エネルギーを獲得する硝酸呼吸をおこなうことができる。脱窒を担う酵素群のなかで一酸化窒素を亜酸化窒素(N_2O)に還元するのが一酸化窒素還元酵素(NOR)である。NORは好気呼吸の末端酸化酵素であるシトクロムcオキシダーゼ(CcO)とアミノ酸配列の相同性が見られることなどからNORはCcOの祖先分子であるとみなされており、呼吸酵素の分子進化の観点からも興味深い。本研究ではNORやCcOの機能発現の鍵となる気体分子複合体の結晶構造解析から、呼吸機能の進化の仕組みを解明することを目的としている。本年度はNOR単独での結晶構造の解明を目標として研究を進めた。ターゲットして結晶化および構造決定の可能性が高いと期待される好熱菌Bacillusslearothermophillus由来の好熱性NORを選定した。本酵素をゲノムからクローニングし、遺伝子を大腸菌に組み込んだ発現系を構築した。大腸菌培養液1リットル当たり精製酵素を約0.5mg得ることが出来た。この標品について一酸化窒素還元活性、吸収スペクトル、電子常磁性共鳴スペクトルを測定し、一酸化窒素還元活性を発現できる活性部位を保持していることを確認した。結晶化スクリーニング、結晶化条件の最適化により2.75A分解能の反射を与える単結晶を得ることに成功した。現在までにほぼすべてのアミノ酸残基のモデル構築をほぼ終えている。これは世界に先駆けた膜結合型一酸化窒素還元酵素の結晶構造解析であり、本酵素と気体分子との複合体の構造解析による呼吸機能の分子進化のメカニズム解明に向けて極めて重要な基盤を築く結果である。現在更なる分解能の向上を目指して精製、結晶化条件の検討を進めている。
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