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Death receptorの下流でcaspase-8の活性化を制御する分子として我々が発見・クローニングした巨大分子FLASHが細胞増殖のS期進行に必須の分子であることを見いだしたので、そのS期進行に関わる分子機構を明らかにすることを目的に、またFLASHのconditionalノックアウトマウスを作製・解析することによってその生理機能を明らかにすることを目的に研究を行い下記の結果を得た。
A)Tetリプレッサーとレンチウイルスベクターのシステムを用いてFLASH特異的shRNAの発現誘導系を構築し、FLASHのノックダウン誘導によって細胞周期のS期進行が停滞するヒトKB細胞由来株を作製した。
B)上記KB細胞株にEGFPで標識したマウスFLASHをレンチウイルスベクターによって導入し、FLASHノックダウンによる表現系がレスキューされることを確認した。さらに、各種欠失変異体FLASHを発現させることにより、従来重要とされていたC末端はS期進行に必須ではないことを明らかにした。
C)FLASHと会合する候補分子を、上記C末端欠失変異体FLASHと共免疫沈降する分子としてLC-MS/MS解析で3種類同定した。これらの分子のノックダウンをKB細胞で誘導したところ、一つの分子の発現抑制によって細胞周期S期の進行が停滞した。この分子とFLASHとの結合が細胞周期のS期進行に必須であることを示す実験を行っている。
e)FLASHコンディショナルノックアウトマウスの作製のためのコンストラクトを作製し、ヘテロ接合体ES細胞を作製した。
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