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超好熱古細菌(Pyrococcus horikoshii)RNase Pの構成タンパク質(PhoPop5、PhoRpp21、PhoRpp29、PhoRpp30、PhoRpp38)の構造との機能について検討した。
まず、大腸菌RNase P RNA (M1RNA)に、5種の超好熱古細菌(Pyrococcus horikoshii) RNase Pタンパク質を添加し、5mM Mg^<2+>存在下、pre-tRNA切断活性の有無を検討したところ、いずれのタンパク質もM1 RNAを活性化しなかった。一方、50mM Mg^<2+>存在下で大腸菌タンパク質C5を古細菌タンパク質とともに古細菌RNase P RNA(PhopRNA)に添加し、C5のPhopRNAへの影響を検討した結果、C5タンパク質も古細菌PhopRNAを活性化しなかった。続いて、M1 RNAのSおよびCドメインと、PhopRNAのSおよびCドメインを相互に入れ替え、各タンパク質の存在下、酵素活性の有無を10mMおよび50mM Mg^<2+>存在下で検討した。その結果、M1 RNAのSドメインとPhopRNAのCドメインからなるRNAは、古細菌タンパク質PhoPop5とPhoRpp30の存在下で酵素活性を示した。一方、M1 RNAのCドメインとPhopRNAのSドメインからなるRNAでは、タンパク質C5と古細菌タンパク質PhoRpp21、PhoRpp29の存在下で活性を示した。
以上の結果より、古細菌タンパク質PhoPop5とPhoRpp30はPhopRNAのCドメインの活性化に関与し、PhoRpp21とPhoRpp29はPhopRNAのSドメインの活性化に関与していることが示唆された。
次に、PhoRpp21とPhoRpp29の複合体の結晶構造を分解能2.2Aで決定した。その結果、PhoRpp21とPhoRpp29はヘテロ二量体を形成し、PhoRpp21のN末端側の2本のα-ヘリックスα1とα2)と、PhoRpp29のN末端領域、中央領域(β2)、C末端付近のα-ヘリックス(α3)との間で相互作用していた。これらの相互作用の重要性を確認するために、相互作用面への変異の導入によるRNase P活性への影響を検討したところ、いずれの変異も触媒活性の低下を示したことから、PhoRpp21とPhoRpp29の複合体形成が触媒活性に重要であることが検証された。また、複合体の表面電荷を計算したところ、複合体形成により特定部位に正電荷を帯びた面が創られ、この面がRNA (pRNA、pre-tRNA)との相互作用部位であることが示唆された。以上の結果を踏まえ、PhoRNase Pホロ酵素の全体構造を推定した。
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