研究概要 |
[PylRS変異体の開発とタンパク質蛍光標識法の拡充]古細菌Methonosarcina mazei由来のピロリジルtRNA合成酵素(PylRS)のアミノ酸結合部位に,立体構造情報に基づいてアミノ酸置換を導入して,Nε-ベンゾイルオキシカルボニルリジン(Z-Lys)に特異的な変異体を作成することに成功した.Z-Lysは,PylRSの本来の基質であるピロリジンに比べてもさらに大きなアミノ酸である.この変異体を利用して,Z-Lysのアリール基上にアジト基を導入したアジド-Z-リジン(AzZLys)を,哺乳類細胞,大腸菌のそれぞれのシステムでタンパク質に導入することができた.さらに,アジト基とトリアリール・フォスフィンの選択的な反応を利用して,タンパク質を部位特異的に蛍光標識することに成功した.昨年度のアジトフェニルアラニンを用いる方法に加えて,さらにAzZLysを用いる蛍光修飾法を開発したことで,用途に合わせて,いずれかの方法によってタンパク質を部位特異的に蛍光標識することを可能にした. [アセチルリジンの部位特異的導入法の開発]アセチルリジンは,ヒストンのC末端付近に見出される翻訳後修飾アミノ酸であり,クロマチンの動態変化に主要な役割を果たしている.そこで,アセチルリジンをタンパク質に部位特異的に導入するシステムを開発した.アセチルリジンを認識するMethonosarcina barkeri由来のPylRS変異体が,他の研究グループから報告されていたが,変異をM.mazei PylRSに移植した上で改良を施したmAcLysRSを作成した.mAcLysRSを哺乳類細胞で発現させることによって,アセチルリジンを部位特異的に導入したタンパク質の調製に成功した.質量分析によって,指定の位置にアセチルリジンが導入されたことが確認された.
|