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Rad18タンパク質は、ヒトユビキチン結合酵素であるRad6と複合体を形成し、DNA上に損傷があっても働く損傷乗越えDNAポリメラーゼの中で特に紫外線による皮膚癌と関係する重要なDNAポリメラーゼηが働くためのシグナルとして、DNA複製の足場タンパク質であるPCNAをユビキチン化するユビキチンリガーゼである。最近、我々は、Rad18が複製フォーク様DNAに強く結合することを見出し、複製DNAポリメラーゼが損傷部位で複製を停止した状態をRad18が認識してPCNAのユビキチン化するという新しいモデルを提案した。本研究では、このモデル超分子複合体であるRad18/Rad6複合体とフォーク様DNAやPolηC末のRad18結合ドメイン(Polη158C)との3元複合体のX線結晶構造解析を行い、損傷乗越えDNA修復の初期機構を3次元構造レベルで解明することを目的としている。
Rad6/Rad18複合体はバキュロウイルス/SF9細胞の系でそれぞれの遺伝子を共発現させ、すでに確立させた方法(Niカラム、イオン交換カラムとゲルろ過カラムを使用)で高純度に精製し、数mg/mlに濃縮、結晶化のスクリーニングを行った。Rad18/Rad6複合体は、時間が経っと凝集を起こすので、サンプル調製は結晶化に合わせ随時行った。それらの結果、TOPAZシステムを用いた自由界面拡散法による結晶化スクリーニングで、結晶を得ることに成功した。今後、データ測定、Rad18に含まれるZn原子の異常分散項を利用した多(単)波長異常分散法での構造解析に進む予定である。
Rad18/Rad6複合体とフォーク様DNAやPolη158Cとの3元複合体については、結晶化のスクリーニングを行っている。
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