研究課題
(1) p45を含む核内複合体、細胞質内複合体の精製と分析NF-E2によるユニークな転写活性化機構を明らかにするために、NF-E2を含む転写複合体を精製し、その構成因子を質量分析により同定した。巨核球系培養細胞MEG01細胞にFlag-HAダブルタグのついたp45の発現ベクターをレトロウィルスを用いて導入し、安定遺伝子導入株を樹立した。この遺伝子導入細胞から、核抽出液を調製し、抗Flag抗体による免疫沈降とそれに引き続く抗HA抗体によるpull downを行い、p45と結合する蛋白質複合体を得て、質量分析により、各構成蛋白質を同定した。その結果、クロマチンリモデリング因子、DNA修復因子、脱アセチル化酵素などが得られた。(2) 巨核球系培養細胞MEG01におけるp45のノックダウンNF-E2複合体の構成因子の機能的重要性を検討するために、MEG01細胞が利用できるかどうかを検討した。MEG01細胞に対して、p45のsiRNAを導入したところ、内在性のp45の発現の発現を減少させることができた。このときに、巨核球におけるNF-E2の標的遺伝子として、報告されているトロンボキサン合成酵素遺伝子(TXS)の発現が減少することを確認した。ただ、p45mRNAが減少するわりには、TXS mRNAの減少の程度があまり顕著でないこともわかった。そこで、p45により大きく依存していることがわかっている巨核球初代培養において、レトロウイルスで遺伝子をノックダウンする実験系を試みることにした。胎児肝臓をトロンボポエチン存在下で培養し、shRNAを発現するレトロウィルスを感染させ、遺伝子のノックダウンを図るために、現在、ウイルスの感染条件を検討中である。
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生化学 (印刷中)
Mol. Cell. Biol 28
ページ: 2758-2770
