| 研究概要 |
1.機能的抗AIM抗体の作製とその治療的応用の検討
AIMの機能を抑制することが可能な抗体作製を目指した。そのために,293T細胞にHAタグを負荷したマウスAIM蛋白を産生させ,大量の培養上清から抗HA抗体カラムを用い,AIM-HA蛋白を1mg程度精製した。これをマウスに免疫し脾細胞からハイブリドーマを作製,スクリーニングし,35種類の抗AIM抗体産生クローンを確立した。そのうち,17クローンの抗体がヒトAIM蛋白も認識することが分かった。
2.ヒト血中ANM濃度測定法(ELISAによる)の確立
ヒト血清中のAIM濃度を動脈硬化のマーカーとして応用するために,上記項目1にて作製した抗体の中から2種の抗体を用い,ヒトAIMに対するELISA測定系を確立した。
3.AIMに結合するタンパク質の同定
AIM受容体の単離,もしくはAIMのアポトーシス抑制機能のメカニズムを明らかにするために,AIMに結合するタンパク質同定を以下の方法で試みた。
(1)Expression screening法
J774.1マクロファージ細胞から誘導効率のよいcDNAライブラリーを作製した。発現しているすべてのmRNAによるものと,シグナルペプチドを有する膜型(および分泌型)タンパクをコードするmRNAのみをエンリッチしたもの,2種類を作製した。これらのライブラリーを293T細胞に導入し,上記のように作製,精製したマウスAIM-HAタンパクを用い,受容体のスクリーニングを行った。
(2)プロテインアレイ法
上記1にて作製したAIM-HAタンパク質を用いて,プロテインアレイ法により結合タンパク質を探索した。実際の結合については現在解析中である。
(3)Yeast two-hybrid法
Yeast two-hybrid法を用いて,AIMに結合するタンパク質を探索した。
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