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食道癌においてmiR-21の発環が正常組織より高いことがqRT-PCRにて明らとなった。miR-21の発現と病理学的検討では、腫瘍径およびリンパ飾転移と有意な相関があったことから、miR-21が癌促進因子として作用している仮説をたて、miR-21のターゲット遺伝子の同定と機能的活性について検証した。組織中において、miR-21発現細胞が浸潤白血球や聞質細胞でないことを確認するため、in-situ hybridizationを行った。癌細胞からmiR-21が著明に発現していることが確認できた。次に培養癌細胞を複数用いて、miR-21の発現を検討した。全てに発現亢進を認めた。癌細胞にmiR-21の発現を抑制するantisense-miR-21 oligonucleotideの遺伝子導入を行ない機能解析(増殖・浸潤能)を行った。WTS assayにて増殖能を検討し、miR-21が有意にに足進的に作用した。Matrigel ceoated insert chamber assayによる浸潤能を解析したところ、miR-21は有意に浸潤能を亢進させた。
次に、miR-21のターゲット遺伝子の検索のため、bioinformaticsによる解析と最近の報告などによる検討から、癌抑制遺伝子であるPDCD4(programmed cell death4)の3'-UTRと配列が一致することが分かった。まず、癌細胞株におけるmiR-21の発環とPDCD-4蛋白の発現量を比較すると、有意に逆相関することが分かった。PDCD4遺伝子の3'UTRをplasmisに組み込みLuciferase assayを行い、antisense-miR-21oligonucleotideの存在の有無による解析の検証から、miR-21がPDCD-4のターゲット遺伝子であることが判明した。PDCD4は蛋白の翻訳制御に関わることから、今後PDCD4とmiR-21の発現の意義についてさらに解析していく予定である。
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