| 研究課題/領域番号 |
19390527
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
佐伯 修一 東北大学, 大学院・歯学研究科, 大学院非常勤講師 (60271954)
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| 研究分担者 |
春山 直人 東北大学, 大学院・歯学研究科, 助教 (70359529)
五十嵐 薫 東北大学, 大学院・歯学研究科, 教授 (70202851)
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| キーワード | 軟骨 / アメロジェニン / スプライスアイソフォーム / 動物モデル / エナメルタンパク |
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| 研究概要 |
本研究の目的はマウスアメロジェニン(AmelX)のスプライスアイソフォームの軟骨分化・形成における役割を明らかにすることであり、本年度はトランスジェニックマウスを作成し解析するのに必要な準備を行う期間であった。まず、スプライスアイソフォームであるM180とLRAPのcDNAフラグメントを所有のプラスミドから適切な制限酵素で切り出し、pcDNA3.1myc-hisベクターに載せ替えを行い、目的のタンパクが正常に発現できるかどうか抗アメロジェニン抗体および抗mycタグ抗体を用いてウェスタンブロッティング法にて確認を行った。その結果、どちらの抗体でもスプライスアイソフォームに応じたサイズのタンパク発現が確かめられた。このベクターを現在ATDC5(マウス株化軟骨細胞)に遺伝子導入し、Q-PCR法により軟骨分化関連マーカー(II型、X型コラーゲン、Cbfa1、Sox9、MSX2、PTHrP等)発現量の変化を検索中である。これと平行して、トランスジェニックマウス作製用ベクターの作製も行っており、動物において導入遺伝子の発現パターンがリアルタイムに観察できるよう目的タンパク質をEGFP(改良緑色蛍光タンパク)と同時に発現させるため、pIRES-EGFPにまず目的cDNAの組みこみを行ったところである。
今後は、過去に発現パターンが詳細に解析されているII型コラーゲンプロモーター下流にアメロジェニンcDNA-IRES-EGFP部分のサブクローニングをおこない、ATDC5細胞にて発現が可能かどうか確認を行った後に遺伝子改変マウス作成受託サービス会社へ送付し、ファウンダーマウスを複数得る予定である。
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