| 研究概要 |
細胞膜透過性を有するペプチド配列を用いた蛋白質導入法の新規技術の開発及びその応用方を目的とし,非天然アミノ酸を導入できる試薬を用いての合成法を、特に細胞膜透過配列の検討に着目し改良し、蛋白質導入効率の向上を達成した。蛋白質導入の効果をより実際的に判定できるアッセイ系の開発の為,ヒスチジンタグ及び核移行シグナル配列が付加されたCreリコンビナーゼの発現ベクターを構築し、精製し、純品を得た。この蛋白質の導入により、細胞の核内で組み換えを起こすloxP配列を用いたレポーターベクターを作成した。これらのベクターを導入された細胞は活性のあるCreリコンビナーゼが導入されると緑色蛍光から赤色蛍光に発するか、ルシフェラーゼ蛋白質を発現させる。Creリコンビナーゼの細胞導入を試みた所、用いたHela COS細胞とも非常に高い効率で導入された事を証明できた。本実験に用いた蛋白質は蛋白質の構造が弱いため、細胞膜透過シグナルを付加して合成すると、付加ペプチドの変成作用により機能を失われやすくその遺伝子組み換え活性を高く保つ事が困難との報告がされているが,本研究課題で開発した混合活性化の手法を用いる事によりこの蛋白質の活性を高く保持したまま、精製し、細胞に導入出来る事が証明された。本手法の有効性を証明するために、血液幹細胞を誘導出来るHoxB4蛋白質の発現ベクターを作成した。また、本手法は機能を持った蛋白質を用いる事が重要であるが,通常この調製は困難な事が多い。そこでこの問題を克服する為、糖鎖修飾を利用した非調節性細胞外蛋白質放出ベクターの作成に成功し、蛋白質の容易な調整を可能とした。
|
