| 研究概要 |
1ハブ毒タンパク質C型レクチン様ドメインをコードするゲノムDNAの構造解析IXIX-bp B鎖のcDNAの配列をもとにプライマーを設計・合成し,ハブゲノムDNAを鋳型として,PCRによりB鎖遺伝子DNA断片の合成とベクター(pCT4-TOPO等)への挿入,塩基配列の解析を行った。エキソン1〜11間のエキソン-イントロン構造や,エキソン部分とイントロン部分の塩基配列の変異度等を,既に解析したハブIXIX-bPA鎖遺伝子と比較した。
2ハブ毒に含まれる蛋白質cDNAの構造解析 ハブ毒腺cDNAライブラリーをプレート上に植え拡げ,独立したクローンを無作為にpickupし,塩基配列を解析した。ライブラリーは,cDNAを大きさに従っていくつかに分画し,ベクターpSPORT-1に挿入することにより作製した。解析の容易さを考慮しIX/X-bp等と同程度の大きさ(700-1000bp)のものから約40クローンを順次解析した結果,ホスホリパーゼA_2類,メタロプロテアーゼ類,BPPICNP前駆蛋白質等の配列が得られた。
3ハブ・ゲノムライブラリー構築 これまでに得られた結果から,ハブ・ゲノム上には毒蛋白質をコードする類似の遺伝子(偽遺伝子も含め)が多数存在する可能性が考えられ,PCRによる部分的な断片作成では毒蛋白質コード遺伝子全体の構造解析が困難と思われたので,新たにハブの組織を調達し,ゲノムライブラリーを構築した。
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