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本研究では、宿主由来の生体膜を内包するバクテリオファージPR772のウイルス粒子産生機構を利用して、その生体膜中に新規GPCRを発現させ、組織抽出液と混合し、GPCRに結合したリガンドスクリーニング法を確立し、リガンドを同定することを目的とする。今までの研究により、PR772のウイルス粒子形成に必要なメジャーキャプシド蛋白質P3、膜蛋白質P16、マイナーキャプシド蛋白質P30、ペントン蛋白質P31のN末端にHisタグを付加したHis・P31の4種の蛋白質を同一の大腸菌で発現させ、菌体内で、Hisタグが粒子の表面に露出した生体膜内在性のウイルス様粒子(His・VLP)を再構成させ、Ni-アガロース用いて精製することに成功している。本年度は、まず、GPCRを内包したHis・VLPの再構成系を確立するために、GPCRの3つのサブファミーリーのうち、リガンド不明なオーファンGPCRが多く存在すると推定されているファミリー1aの中で最も代表的なロドプシン(オプシン)を選び、そのC末端にペプチドリンカーを介してウイルス膜蛋白質P16のN末端を連結した融合蛋白質をP3、P30、His・P31と共に同一の大腸菌で発現させることにより、融合蛋白質が粒子形成に影響を与えず、脂質膜と共にHis・VLPに取り込まれるか、短縮型オプシンを用いて調べた。オプシンの第1-第3膜貫通領域を含む短縮型オプシンのC末端にグリシン・セリン・セリンから成るペプチドリンカーを介してP16を連結させた融合蛋白質発現用プラスミドを作製し、融合蛋白質と上記ウイルス蛋白質を同一大腸菌で発現させ、菌体内で生成した粒子をNi-アガロースで精製して解析した結果、融合蛋白質を含有すると推測される生体膜内在性のHis・VLPが確認された。
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