| 研究課題/領域番号 |
19560779
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| 研究機関 | 崇城大学 |
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研究代表者 |
小川 隆平 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (40029244)
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| 研究分担者 |
松岡 正佳 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (10121667)
長濱 一弘 崇城大学, 生物生命学部, 准教授 (50248605)
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| キーワード | エチレン / エチレン生成酵素 / 耐熱化 / Thermus thermophilus / 2-オキソグルタル酸 |
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| 研究概要 |
Pseudomonas syringae pv.phaseolicola PK2由来のエチレン生成酵素(EFE)は基質である2-オキソグルタル酸(2-OG)からエチレンとコハク酸を2:1に作る新規な酵素であり、本研究ではEFEのin vivo系での耐熱化にこの性質を利用した。具体的には2-オキソグルタル酸-NAD酸化還元酵素の遺伝子(sucA)を破壊した sucA-株を作成する。次いで、本菌株中にエチレン生成酵素遺伝子(efe)を導入し、高温条件下で培養を行う。本来EFEはその最適温度が25℃で、40℃を超えるとほぼその活性を失ってしまうが、このようにして調製された好熱菌を60℃で培養し、菌の生育が認められればEFEの耐熱化により好熱菌のコハク酸要求性が相補できたことになり、耐熱化EFEがin vivo進化的に得られる。実際の実験では、まず、染色体上のsucAをプラスミドpMOSBlueにクローニングした。次いで好熱菌由来leuプロモーター領域をpMOSBlueにクローニングし、選択マーカーとなる好熱菌pyrE遺伝子ORFをleuプロモーター下流に連結してpMOSBlue-Pleu-PyrEを作成した。現在、EFEの耐熱化実験までは至っていないが、今後、今回調整したプラスミドのPleu-PyrE断片をsucA内部に挿入したpMOSBlue/sucA/Pleu-PyrEを作成後T.thermophilusを形質転換し、本菌株がコハク酸要求性を示すかの検討を行い、その後EFE耐熱化を試みる予定である。
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