| 研究概要 |
MCM(minichromosome maintenance)は6個[MCM2-7]の構造的に類似したタンパク質からなる複合体で、複製ライセンス因子の本体であり、複製開始に必須である。MCM4-6-7複合体はDNAヘリカーゼ活性を有することから、MCMは複製フォークにおけるDNAヘリカーゼの一部として機能すると考えられている。我々は、MCMのヘリカーゼ活性は、鋳型DNA上のT-rich一本鎖DNAにより活性化されること、およびCdt1と結合して複合体を形成しより強いヘリカーゼ活性を示すこと、さらにCdt1はATP結合によりその活性が制御される可能性を見出した。本年度は、Cdt1配列上に、典型的なATP結合ドメインとは異なる配列を有するATP結合タンパクとの相同配列を見出し、その保存配列の変異体を作製した。この変異体はin vitroでATP結合能をほぼ完全に消失していた。さらに、これと同じ変異がショウジョウバエの発生異常の原因として独立に同定されていることが明らかとなった。以上の事実は、Cdt1のATP結合は、その機能制御に重要な役割を果たすことを示す。
DNAプライマーゼはDNA複製において、RNA断片(プライマー)を合成する酵素である。バクテリアでは、DNAプライマーゼは複製フォークにおいてDNAヘリカーゼに結合し、複合体として互いに活性を促進する。しかし、真核細胞では、プライマーゼとヘリカーゼの関連する研究はまだ進んでいなかった。我々は,精製したhuman DNAプライマーゼとMCM複合体を用いて、相互作用と活性制御について生化学的に調べた。免疫沈降によりhuman DNAプライマーゼ(p48とp58サブユニット)はMCM2〜7複合体と共沈降した結果から、MCM2〜7複合体とhuman DNAプライマーゼが物理的に相互作用しることを見出した。現在、MCMヘリカーゼとDNAポリメラーゼ・プライマーゼの間、互いに活性への影響を解析している。
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