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本研究では、(1) 主にプロテオミクス手法を用いて GCNF 複合体構成の全貌を明らかにすること、(2) クロマチン免疫沈降法を用いて GCNF 依存的標的遺伝子を探索することを目標としている。これらの実験のためには GCNF 特異抗体が必要である。最初に作製した抗体は、細胞内発現量の高いスプライシング因子にクロスすることが問題であったため、もう一度 GCNF に対する抗体を作製した。まず、M2 アガロースビーズと GCNF 抗体磁性ビーズを順に用いて FLAG-GCNF と Dnmt3a を共発現させた HEK293 安定形質変換株の核抽出液から GCNF 複合体のタンデムアフィニティ精製を試みた。また、ES 細胞から胚様体を形成させて分化させた細胞の核抽出液から GCNF 複合体の精製を試みた。どちらの場合にも共通して GCNF 相互作用分子として検出されたのが、Trim28 であった。COS7 細胞に FLAG-Trim28 とタグのない GCNF を発現させて抗 GCNF 抗体で免疫沈降した結果、FLAG-Trim28 が共沈した。Trim28 は KRAB zinc finger タンパク質を介して発生初期の新生 DNA メチル化に関与することが示唆されている。また、Trim28 の HP1 binding domain が Oct4 の発現調節に関与することが示唆されている。GCNF と Trim28 が発生初期に果たして機能的に関連しているのかどうかが今後の検討課題となった。
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