| 研究概要 |
オートファジーはオートファゴソーム(以下AP)と呼ばれる,脂質二重層の二重膜により区画化されたオルガネラを介して,タンパク質やオルガネラを非選択的に液胞に輸送する細胞内分解システムである.最近になって,タンパク質やオルガネラがAPに選択的に取り込まれることが細胞の機能維持に重要であることが分かってきた.
申請者は,APを単離した後,質量分析法を用いて新規のマーカータンパク質を同定することを目標に本年度の研究を進めてきた.これらのタンパク質はAP形成の分子装置である可能性と,新たな積荷タンパク質である可能性がある.これらの解析を通じて,オートファジーの分子機構と生理的な意義を一層深く理解できると期待される.
APの内容物から細胞質成分を排除するためにAPの積荷タンパク質としてよく知られているアミノペプチダーゼ1(以下Ape1)を過剰発現した.ApelはAPに最優先で取り込まれ,Apelで満たされたAPが形成されることが確認された。また,GFPを融合したApe1を発現させることにより,生細胞内または細胞破砕液中でAPを蛍光顕微鏡下に追跡する手法を確立した.この手法を用いて,APに様々な処理を行い,APの化学的性質を詳細に解析した.また,本年度は電子顕微鏡を用いて細胞破砕液中のAPを同定することに初めて成功した.これまで確立したAPのモニタリング法を統合して応用することにより,生化学的手法を用いてAPを濃縮した画分を得ることに成功した.現在,AP画分に特異的に検出される複数の候補タンパク質を質量分析法により同定しつつある.
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