| 研究概要 |
チューリップ花弁は日中開き、夜間には閉じるが、この応答は温度依存的であり、開花のなめには水の輪送が必須で、水チャンネルの活性化が起こる。チューリップ花弁の水チャネルを構成するアクアポリンの分子種を同定するために、細胞質アクアポリン遺伝子4種類(TgPIP1-1, TgPIP1-2, TgPIP2-1, TgPIP2-2)をクローニングした。
これらの遺伝子産物のうちで、TgPIP2-2アクアポリンが水の輸送に関与する分子種であることをアフリカツメガエル卵母細胞で発現させる機能面から確証した。アクアポリンのリン酸化により水輸送活性が活性化され、脱リン酸化により不活性化されることが知られているが、リン酸化または脱リン酸化の阻害剤が水チャンネル活性に影響することを確認した。
リン酸化を受けるセリン残基および水銀に感受性のサイトをSDM手法で確証した。TgPIP2-2のセリン残基35,116,188,274,277をアラニンに置換した変異体から、35,116,274番目に位置するセリンがリン酸化される候補であると予測し、これらのダブル、トリプル変異体を作成した。これらの変異体を用いて、リン酸化や脱リン酸化阻害剤の効果から、リン酸化を受けて水チャンネル活性を増加させる3種のセリン残基であると確定した。
チューリップの花弁、葉、茎、塊茎、根における4種類の遺伝子発現量をRT-PCR報により比較した結果、水チャンネル活性が認められたTgPIP2-2がどの組織、器官においてもその発現量が最も高いことが確認された。根で吸収された水が植物体全体へと伝搬されるチャンネルがTgPIP2-2の翻訳産物で構成されており、チャンネルの活性化にリン酸化が関与している可能性を指摘できた。
TgPIP2;1とTgPIP2;2を酵母(ピキア)に発現させ、調製したスフェロプラストの浸透圧変化に伴う破裂を追跡することで、水チャンネル活性を図る手法を新たに導入した。リン酸化脱リン酸化の阻害剤が活性に影響したことから、簡便に水チャンネル活性を測定できる系であるとともに調節機構を検証するための優れた方法であると結論した。
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