| 研究概要 |
本研究では、トランスゴルジネットワーク(TGN)-エンドソーム輸送を制御するクラスリンアダプターの作用機序を解明するために、蛍光タンパク質(mGFPやmcherry)を融合させたAP1, GGA1, GGA2, GGA3、およびカチオン非依存性マンノース6リン酸受容体(CIMPR)を遺伝子構築により作成し、哺乳類細胞で発現させ、顕微鏡下におけるライブセルイメージングを行うものである。
1.本年度はmcherry-GGA1を安定に発現するHeLa細胞を作製することに成功した。同細胞にmGFP-AP1を一過性に発現させ、マルチカラー観察によってGGA1とAP1の相互関係を解析したところ、両者はトランスゴルジネットワーク(TGN)で一部共局在を示すが、TGNから離れてゆく輸送キャリアー様構造のほとんどはmcherry-AP1のみに陽性であった。この結果は、GGA1はTGN、AP1はTGNからエンドソームにかけて機能することを示唆する。次の段階として、FRETによるGGA1-AP1の相互作用を検討する予定である。
2.GGA1,2,3のノックダウン実験系を確立し、その一部は論文受理された(Hida, et. al., in press)。今後は、同細胞においてmcherry-GGA1,2,3を発現させ、過剰発現によるアーチファクトを除外した解析を行う予定である。
3.CIMPRをより生体に近い状態で観察するため、mcherryを融合させた"全長"CIMPRを作製した。現在、同タンパク質をMPR欠損線維芽細胞に発現させ、安定発現株を作製中である。
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