| 研究概要 |
インスリンの作用は、我が国を含むアジア系諸国において、2型糖尿病の成因に深く関わる。そして、その分泌不全は疾患を引起す原因の一つと考えられている。分泌の最終過程にあたる開口放出、およびその準備段階にあたる分泌顆粒の動員機構にも、異常の存在が示唆される。
分泌顆粒を光活性型GFPで蛍光標識するために、PAGFP-insulin,PA-venus insulin,PAvenus-VAMP2などの各種cDNAを発現するベクターを作成し、INS-1細胞、膵島などへの発現を検討してきた。並行して、インスリン顆粒内部は強酸性を示すためか、顆粒内容物を標識しても光活性化が適切に起こらないとの情報を得た。また、顆粒に発現するSNARE蛋白であるVAMP2を標識した場合には、大型有芯小胞以外の細胞内小器官も標識されることが判明した。そこで、現在はインスリン顆粒膜に特異的に発現するphogrinを蛍光標識する方針に変換してベクター作成を進めている。
また、膜融合の準備状態を検討するために、細胞膜に発現するSNARE蛋白であるSNAP25に二種類のGFP変異蛋白を挿入したFRETプローブも複数作成し、SNAP25の複合化と膜融合の潜時の関連について検討した。グルコース刺激・もしくはケイジドカルシウム刺激による分泌を誘発した場合、早期に分泌される部位ほどFRET比があらかじめ高いことを示し、また、高い領域の空間分布に関する画像解析も進めている。
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