L型CaチャネルのCa依存性促通と不活性化の分子機構

2008 年度 研究成果報告書

• 研究課題/領域番号: 19590210
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 生理学一般
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 亀山 正樹 鹿児島大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (60150059)
• 研究分担者: 矢澤 和人 鹿児島大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (90212274) ; 蓑部 悦子 鹿児島大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教 (00448581)
• 研究協力者: はお 麗英 中国医科大学, 薬学院, 教授 ; 亀山 亜砂子 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 元講師 ; 徐 建軍 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 大学院生 ; SAUD ZAHANGIR A. 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 大学院生 ; 王 午陽 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 大学院生 ; 聶 宏光 中国医科大学、鹿児島大学, 中国医科大学、医歯学総合研究科, 大学院生、短期留学生 ; 韓 冬雲 中国医科大学、鹿児島大学, 基礎医学院、医歯学総合研究科, 大学院生、短期留学生 ; 白 暁彦 中国医科大学、鹿児島大学, 基礎医学院、医歯学総合研究科, 大学院生、短期留学生 ; 郭 鳳 中国医科大学、鹿児島大学, 基礎医学院、医歯学総合研究科, 大学院生、研究生 ; 劉 彦 中国医科大学、鹿児島大学, 基礎医学院、医歯学総合研究科, 大学院生、短期留学生
• 研究期間 (年度): 2007 – 2008
• キーワード: Caチャネル / 心筋細胞 / パッチクランプ / カルモジュリン / カルモジュリン依存性蛋白キナーゼ

研究概要

本研究は、L型Caチャネル活動に対するCaMやCaMKIIの作用機序をCa依存性促通と不活性化との関連で解明することを目的として実施された。CaMについては、これ迄の研究で、CaMがL型Caチャネルα1サブユニット(Cav1.2)のN末部(NT)、リピートI-II間の細胞内ループ(LI-II)、C末部のIQモチーフ領域(IQ)およびpre-IQ領域(CB)を含む近位部(CT1)に結合することが判明している。本研究では、CaチャネルのNT、LI-IIおよびCT1領域へのCaM結合のCa依存性についてpull-down法で検討した。CaMのNT、LI-IIおよびCT1への結合の親和性はCa濃度の高低両条件下で、CT1>NT>LI-IIであった。これより、CaM結合の親和性はCa濃度に関わらずCT1が最も高く、この部位がチャネル活性のCaMによる調節に最も重要であることが示唆された。一方、モルモット単一心筋細胞を用いたパッチクランプ実験では、CaMおよびCa結合能を消失させた変異CaM(CaM_(1234))がcell-free状態(inside-outパッチ)によりrundownさせたCaチャネル活性を濃度依存的に回復させることが判明した。このチャネル活性化作用は野生型CaMではCa^(2+)依存性を示したが、CaM_(12)(N-lobeのCa結合能を無くした変異体)、CaM_(34)(C-lobeのCa結合能を無くした変異体)、CaM_(1234)ではCa^(2+)非依存性であった。これより、CaMのCa依存性作用には、N-lobeとC-lobeとの両者が必要であると示唆された。さらに、Caチャネルに対するCaMKIIの作用についても検討した。その結果、チャネルC末部にCaMKIIのリン酸化部位があること、同部位のリン酸化によりCaMの結合が増加することが判明した。
これらの結果は、Caイオン、CaM、CaMKIIが複雑かつ協調的に作用してL型Caチャネルの活動を調節していることを示している。また、Ca依存性促通にはCa^(2+)/CaMの直接作用とCaMKIIによるリン酸化の両者が関与し、不活性化には主にCa2+/CaMが関与するという仮説を支持する。

研究成果

• [雑誌論文] CaMKII phosphorylates a threonine residue in the C-terminal tail of Cav1.2 Ca^<2+> channel and modulates the interaction of the channel with calmodulin (2009)
  • 著者名/発表者名: Wang WY, Hao LY, Minobe E, Saud ZA, Han DY, Kameyama M
  • 雑誌名: J Physiol Sci (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Calmodulin kinase II activation is required for the maintenance of basal activity of L-type Ca^<2+> channels in guinea-pig ventricular myocytes (2008)
  • 著者名/発表者名: Hao LY, Xu JJ, Minobe E, Kameyama A, Kameyama M
  • 雑誌名: J Pharmacol Sci 108 ページ: 290-300
  • 査読あり
• [雑誌論文] New variants of Nav1.5/SCN5A encode Na^+ channels in the brain (2008)
  • 著者名/発表者名: Wang J, Ou SW, Wang YJ, Zong ZH, Lin L, Kameyama M, Kameyama A
  • 雑誌名: J Neurogenet 22(March) ページ: 1-19
  • 査読あり
• [雑誌論文] Stonefish venom, verrucotoxin, modulates calcium channel activity in guinea-pig ventricular myocytes (2007)
  • 著者名/発表者名: Yazawa K, Wang JW, Hao LY, Onoue Y, Kameyama M
  • 雑誌名: British J Pharmacol 151 ページ: 1198-1203
  • 査読あり
• [雑誌論文] Verrucotoxin inhibits KATP channels in cardiac myocytes through a muscarinic M_3 receptor-PKC pathway (2007)
  • 著者名/発表者名: Wang JW, Yazawa K, Hao LY, Onoue Y, Kameyama M
  • 雑誌名: Eur J Pharmacol 563 ページ: 172-179
  • 査読あり
• [雑誌論文] Calpastatin binds to a calmodulin-binding site of cardiac Cav1.2 Ca^<2+> channels (2007)
  • 著者名/発表者名: Saud ZA, Minobe E, Wang WY, Han DY, Horiuchi M, Hao LY, Kameyama M
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Comm 364 ページ: 372-377
  • 査読あり
• [雑誌論文] Distinct roles of CaM and Ca^<2+>/CaM-dependent protein kinase II in Ca^<2+>-dependent facilitation and inactivation of cardiac L-type Ca^<2+> channels (2007)
  • 著者名/発表者名: Nie HG, Hao LY, Xu JJ, Minobe E, Kameyama A, Kameyama M
  • 雑誌名: J Physiolo Sci 57 ページ: 167-173
  • 査読あり
• [学会発表] Cav1.2 Ca^<2+>チャネルのCaM による調節機構熱処理はPKA活性化を介して心筋細胞L型Ca2+電流を増大させる (2008)
  • 著者名/発表者名: 郭鳳、蓑部悦子、矢沢和人、Asmara H、韓冬雲、はお麗英、亀山正樹
  • 学会等名: 生理学研究所研究会
  • 発表場所: 岡崎
  • 年月日: 20081119-20
• [学会発表] Distinct roles of CaM and Ca^<2+>/CaM-dependent protein kinase in Ca^<2+>-dependent facilitation and inactivation of cardiac L-type Ca^<2+> channels (2008)
  • 著者名/発表者名: Nie HG, Hao LY, Xu JJ, Minobe E, Kameyama A, Kameyama M
  • 学会等名: 第85回日本生理学会(JPS Award Symposium)
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20080325-27
• [学会発表] Functional phosphorylation sites for modulation by protein kinase A in Cav1.2 Ca^<2+> channels (2008)
  • 著者名/発表者名: 蓑部悦子、前田佐知子、はお麗英、王午陽、徐建軍、亀山正樹
  • 学会等名: 第85回日本生理学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20080325-27
• [学会発表] Interactions of N- and C-lobes of calmodulin with the C-terminal tail of Cav1.2 Ca^<2+> channels (2008)
  • 著者名/発表者名: Asmara H, Minobe M, Saud ZA, Wang WY, Kameyama M
  • 学会等名: 第85回日本生理学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20080325-27
• [学会発表] 熱処理はPKA活性化を介して心筋細胞L型Ca^<2+>電流を増大させる (2008)
  • 著者名/発表者名: 王建武、矢沢和人、Zahangir A. Saud、山岡薫、亀山正樹
  • 学会等名: 第81回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 20080317-19
• [学会発表] L型Caチャネルの生理と心筋機能 (2008)
  • 著者名/発表者名: 亀山正樹
  • 学会等名: 東京慈恵会医科大学第1回分子循環器セミナー
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2008-12-17
• [学会発表] Calciumand concentration-dependent effects of calmodulin and its mutants on CaV1.2 Ca^<2+> channels in guinea pig ventricular myocytes (2008)
  • 著者名/発表者名: Guo F, Minobe E, Yazawa K, Asmara H, Han DY, Hao LY, Kameyama M
  • 学会等名: 第59回西日本生理学会
  • 発表場所: 熊本
  • 年月日: 2008-10-03
• [学会発表] 心筋Caチャネルの調節機構 (2008)
  • 著者名/発表者名: 亀山正樹
  • 学会等名: 第11回札幌高血圧セミナー
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 2008-07-04
• [学会発表] Cav1.2チャネルのカルモジュリンおよびCa依存性調節 (2007)
  • 著者名/発表者名: 亀山正樹、韓冬雲、蓑部悦子、王午陽、はお麗英
  • 学会等名: 生理学研究所研究会
  • 発表場所: 岡崎
  • 年月日: 20071113-14
• [学会発表] L型Caチャネルの活動調節におけるカルパスタチンとカルモジュリンの競合 (2007)
  • 著者名/発表者名: 蓑部悦子、韓冬雲、Zahangir A. Saud、王午陽、はお麗英、亀山正樹
  • 学会等名: 第58回西日本生理学会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 20071019-20
• [学会発表] 心筋L型Caチャネルのカルモジュリンによる調節 (2007)
  • 著者名/発表者名: 亀山正樹、韓冬雲、蓑部悦子、王午陽、聶宏光、はお麗英
  • 学会等名: 第24回日本心電学会学術集会
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 20071005-06
• [学会発表] Regulation of cardiac L-type Ca^<2+> channels by calmodulin and CaMKII (2007)
  • 著者名/発表者名: Kameyama M, Hao LY, Han DY, Minobe E, Wang WY, Nie HG, Saud ZA
  • 学会等名: Akita International Symposium
  • 発表場所: Akita
  • 年月日: 2007-05-20