| 研究課題/領域番号 |
19590387
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
村雲 芳樹 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 准教授 (40324438)
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| 研究分担者 |
時々輪 真由美 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, COE特任講師 (50378006)
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| キーワード | REV7 / DNA修復 / 細胞周期調節 / ノックアウトマウス / 結合蛋白 / マススペクトロメトリー |
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| 研究概要 |
REV7ノックアウトマウス樹立のため、REV7遺伝子のスタートコドンを欠損させるようにターゲッティングベクターを新たに構築し、ES細胞にエレクトロポレーションを行った。G418にてセレクション後、耐性クローンを約260個クローニングして、サザンブロッティングにて相同組み換え体のスクリーニングを行ったところ、2個の相同組み換え体が同定された。この2個のREV7遺伝子相同組み換え体からC57BL/6系マウスを用いてキメラマウスを合計9匹作成した。そのキメラマウスをC57BL/6系マウスと交配させ、生まれてきた子供のgenotypeをPCRにより確認したところ、REV7のヘテロノックアウトマウスを得ることができた。ヘテロマウスは外見上wild typeマウスと大きな違いはなく、発育も順調であり、生殖能力もあることまで判明した。
もう一つの課題である新規REV7結合蛋白の同定においては、昨年度同定した蛋白とREV7との結合を、いろいろな条件下での免疫沈降により確認し、更に種々の欠損変異体との結合を確認することにより結合ドメインの決定を行った。また、さらなるREV7結合蛋白の同定のため、GST融合REV7蛋白のpull down、またはタグをつけたREV7蛋白の免疫沈降により共沈してきた蛋白を、網羅的にmass spectrometryにより同定を試みた。その結果、REV7結合蛋白の候補として、DNA修復、発癌、シグナル伝達などに関わる複数の蛋白が新たに同定された。
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