| 研究概要 |
クルーズトリパノソーマ原虫ゲノムに見いだした新しいタイプのキノール酸化酵素
(TcrAOX)について、酵素活性の詳細な検討を行うため、リコンビナントTcrAOX(rTcrAOX)を作成し、大量調製系構築の条件検討を行った。rTcrAOXを大腸菌で発現させる際、内在性のシトクロームbo、bd活性を除去した(Δbo,Δbd)大腸菌を用いることにより、大腸菌の末端酸化酵素活性はすべてrTcrAOX活性に依存する系の作製に成功した。大量培養を行った大腸菌の膜画分を回収し、ユビキノール酸化活性を測定した結果、ユビキノール酸化活性が見られた。従って、rTcrAOXはユビキノール酸化活性を有していることが明らかとなった。さらに、阻害剤を用いた解析により、これまでのAOXの常識とは異なり、その活性はシアン感受性であることが初めて明らかとなった。しかし、大腸菌の第三のキノール酸化酵素活性が、本解析条件で特異的に誘導されている可能性を完全には否定できていないため、大腸菌キノール酸化酵素トリプルミュータント(Δbo,Δbd,Δbd2)を用いての同様の発現系作製に着手した。
さらに、原虫におけるTcrAOXの生物学的機能を解析するため、過剰発現株の作製を行った。まず、pTEXベクターにTcrAOXを組み込み、エレクトロポレーションによりエピマスティゴートに導入した。薬剤によるセレクション後、原虫を回収し、TcrAOX遺伝子特異的なプライマーを用いたRT-PCT、また、TcrAOX特異抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、発現の上昇を確認した。
|
