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昨年度に引き続き本年度において、昆虫細胞による組換えウエストナイルウイルス(WNV)E蛋白の大量発現系を確立するために、以下の2点を行った。
1.バキュロウイルス発現系による組換えWNVE蛋白の作成
WNV(NY99-6922株)由来のPrMとE蛋白質のcDNAが入ったプラスミド(pcWNME)より、PrMの最終45塩基からEの1290塩基(E蛋白質N末端側80%相当部)およびC末端側にHis tag配列を組み込んだprimerを設計してPCR法により同部を増幅、ドナープラスミドpFastBaclのBam HIおよびXho Iサイトに導入して組換えドナープラスミド(pFastBacl-WN80E)を構築した。この組換えドナープラスミドpFastBacl-WN80Eを、bacmidを内在する大腸菌株DH10Bacにtransfectさせることによりtranspositionを起こさせて組換えbacmid(Bac/WE80E)を得た。組換えbacmid Bac/WE80Eを、Sf9細胞株にtransfectさせて組換えバキュロウイルス(Bac.WN)を作成した。この組換えバキュロウイルスBac.WNを感染させたSf9細胞もしくはHigh Five細胞の細胞内および培養上清中には、目的とする組換えWNVE蛋白が発現されていること、さらにこの蛋白質はWNVE蛋白の抗原性を保持していることを、Western blotおよびELISAにて確認した。
2.Drosophila発現系による組換えWNV E蛋白の作成
1とほぼ同様の手法で増幅したWNVのE蛋臼質N末端側80%相当部遺伝子(Eの1から1218番目の塩基)を、発現ベクターpMT/Bip/V5-His AのBgl IIとXho Iサイトに導入した組換え発現プラスミドpMT/Bip-WNEとhygromycir-B耐性プラスミドpCoHygroを、S2細胞にco-transfectしてhygromycin-Bで選択することによりstable transfectant S2. WNを樹立した。このstable transfectant S2. WNを硫酸銅添加により誘導を掛けると、培養上清中に目的とする組換えWNVE蛋白が分泌されること、さらにこの蛋白質はWNVE蛋白の抗原性を保持していることを、Western blotおよびELISAにて確認した。
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