| 研究概要 |
1)コンディショナルノックアウトマウスの作製
Cre-loxPシステムによるコンディショナルジーンターゲッティングの方法を用いた。従来の研究期間に作製していたコンストラクトをもとに最も表現型発現が確実と考えられるexon2を欠失させたinv遺伝子のターゲッティングベクターを構築した。今年度も継続してコンストラクトの作製を行い、完成された後、ES細胞に導入、Southern blotによるコンストラクトの構築の確認を行い終了した。
2)inv機能的遺伝子改変動物および細胞を用いたinvの生理学的、病態生理的意義の検討
機能的遺伝子改変:RNAiの発現vectorおよびadenovirus vectorをHydrodynamic法によりマウス個体、また従来の遺伝子導入により培養細胞で発現させ、mRNA発現レベルを調節した。a)マウス個体でのRNAi、およびadenovirusによる過剰発現:invに特異的なRNAiを発現vectorに組み込み、また、adenovirusによる過剰発現も同様の方法にて急速投与することにより、マウスでの検討を行った。肝臓、腎臓での遺伝子発現profileをmicroarrayで検討し、カドヘリンなどのEMT関連遺伝子の発現の差異が認められた。b)培養細胞におけるRNAiおよびadenovirusによる過剰発現:同様のplasmidを従来通りのlipofectaminを用いたtransfectionをcell line(M1,MDCK,mIMCD3 cell)で行った。同様の遺伝子発現の変化と、細胞形態の変化、細胞の遊離が観察された。
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