研究課題
1)プラズミドの作成:ヒトDHH遺伝子amino-terminal domain coding sequenceをpCMV-Script PCR mammalian expression vector (Stratagene)に組み込んだ。以下の3種類のプラズミドを作成した。86:DHH N末端がストップコドン、87:DHH N末端にHisを6個標識、最後がストップコドン、DHH-myc:DHH N末端にmycを標識し、最後がストップコドン。3種のDHH遺伝子を組み込んだpCMV-Script PCR mamlnalian expression vectorをCOS細胞にtransfectionし、そのcell lysate及びculture supematantを用いて、Western blotを行い、cell lysateにおける蛋白の発現、細胞外分泌を確認した。2)末梢神経損傷モデルの作成:Lewis ratをペントバルビタール腹腔内投与を行い、麻酔下に下肢皮膚を切開し、坐骨神経を露出し、2分間ペンアンで圧迫を加えた。圧迫解除後、圧迫部位及びその近傍の神経東内にプラズミドを注入し、皮膚を縫合した。対照として反対側坐骨神経に同様の損傷を加えた後、DHH遺伝子を含まないプラズミド、または生食を同量注入した。以後臨床症状の観察を行い、2週後または4週後に坐骨神経を採取し、病理学的検討を行った。【結果および考察】1)Cell lysate及びcultule supernatantにおいて、Western blotで約19kDaの蛋白を確認した。これらは抗His抗体及び抗Myc抗体によってそれぞれ特異的に認識された。この結果により、このDHH発現ベクターをtransfectionした細胞において、DHH蛋白(N末端)を産生・分泌することを確認した。2)ラット末梢神経損傷モデルにおける神経再生促進効果:phDHH投与坐骨神経では、生食投与よりも神経線維の再生効果が促進されている例が存在したが、個体差があり、統計学的有意差は得られなかった
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