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生体防御の最前線を担う好中球は減少すると易感染状態をもたらし、逆に過剰に産生されると臓器生涯をもたらす可能性がある。さらに好中球の寿命が24〜48時間と短いために骨髄における生体の需要に応じた適切な産生調節は非常に重要である。近年、申請者は定常状態の造血が転写因子C/EBPαに依存しているのに対して感染などいわば緊急事態の好中球の造血制御においては同じファミリーに属する転写因子C/EBPβ遺伝子の重要性を指摘してきた。
そこで本研究ではC/EBPβ遺伝子の発現調節機構と分化・増殖における機能を解明するために新たなプロモーター活性の解析法とフローサイトメトリーによる好中球造血過程のモニタリングシステムの開発を試みた。
マウス骨髄細胞の試験管内分化系で遺伝子の発現調節機構をモニタリングするためにフローサイトメトリーとレトロウイルスベクターを用いたプロモーター活性の評価系を新規に開発した。レトロウイルスが導入された細胞をThy1.1遺伝子の発現で確認し、興味のあるプロモーターの活性を短半減期型の緑色蛍光蛋白質の蛍光強度で検出するというものである。このプロモーター活性の評価系は造血系における遺伝子発現の転写調節機構に幅広く応用可能であり、本研究においてもC/EBPβのプロモーター領域の活性に必要な領域を明らかにした。
骨髄において好中球は造血幹細胞、骨髄球系共通前駆細胞、顆粒球マクロファージ前駆細胞の分化段階を経て分化成熟する。これまでの研究の成果によりマウス骨髄中のそれらの各細胞集団は蛍光抗体による多重染色を用いたフローサイトメーターにより分離同定が可能となっている。しかし顆粒球マクロファージ前駆細胞からさらに最終的に成熟した好中球へ分化する中間段階の細胞集団についての分離法については開発されていない。本研究ではC/EBPβの作用点を明らかにするためにこのような骨髄中の好中球分化の中間段階の細胞をフローサイトメーターで分離するシステムを開発した。
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