研究課題
本研究の目的は乾癬病変の形成に重要な役割をはたしているSTAT3の活性化にEGFファミリーがいかに関与しているかを明らかにすることである。EGFファミリーすべての因子が発症に関わっているのか、一つの因子のみが重要であるのかについてトランスジェニックマウスを作製し検討する。これまでの研究成果にて、表皮特異的HB-EGF発現マウスは通常生まれてこないため、遺伝子発現誘導マウスを作製しなければならない。タモキシフェン誘導型とドキシサイクリン誘導型の2種類の作製法が知られているが、リークの少ないドキシサイクリン誘導型にてマウスを作製する。Tetシステム発現ベクターであるpTRE-Tight vectorに遺伝子変異を入れたHB-EGFとAmphiregulinのsoluble formとuncleavable formnのcDNAを組込みE。coliにトランスフェクションを行い増幅と精製を行った。表皮特異的に上記遺伝子を発現するために、K5 promoterによるrtTAを発現するベクターを作製する必要がある。Clonthech社のpTet-on-Advavnced vectorのCMVプロモーター領域をK5プロモーターと置換したベクターを作製した。同様にE。coliにトランスフェクションを行い、アンピシリンにてセレクションを行い、増殖、精製した。これらのベクターをマウスES細胞にマイクロインジェクションを行い、トランスジェニックマウスを作製した。HB-EGF-sol、HB-EGF-uc、AREG-sol、AREG-ucのそれぞれについて3-4系統のマウスが生まれた。それぞれのgenotypeをPCRにて確認し、トランスジェニックマウスが作製できていることを確認した。C57/BL6マウスとバッククロスを行い、系統維持を行っている。一方、K5-rtTA-TGマウスはマイクロインジェクションを終了し、マウスが生まれてくるのを待っている状況である。
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