| 研究概要 |
VEGF-Dに対する異なった配列を標的とする4種類の21塩基の2重鎖siRNAを合成した。また、VEGF-CのsiRNAは以前、ノックダウン配列を見出しているが、今回、VEGF-Dと同じ条件の下で、且つより強いノックダウン効率を期待して、同様に4種類のsiRNAを合成した。Negative siRNA controlはいかなるmRNAにも相補性を示さない21塩基の2重鎖siRNAで3'末端がCy5で標識されているものを用いた(Qiagen)。24-well plateを用いて、1well当たり8X10^4個のBJMC3879細胞(マウス乳癌細胞)を撒き、5nMと25nMのNegative siRNA(Cy5標識)を遺伝子導入試薬HiPerFect(Qiagen)にてsiRNAを細胞に導入した。遺伝子導入後、24時間後の遺伝子導入効率をCy5の赤蛍光を指標に計測した結果、5nMでは56%、25nMでは73%の導入効率を示した。次に、VEGF-D並びにVEGF-C siRNAを25nMで遺伝子導入し、24時間後に細胞からRNAを抽出し、real-time RT-PCRにより、ノックダウン効率をGAPDHの相対値によるΔΔCT法により算出した。データがなかなか安定せず、条件検討のため、繰り返し実験を行った。その結果、最大のノックダウンを示した配列は、Controlに比較して、VEGF-D siRNAでは51%ノックダウン, VEGF-C siRNAでは66%ノックダウンであった。その配列のsiRNAとNegative siRNAをpBAsi siRNA発現ベクターに組み込んだ(Takara Bio)。次に, VEGFR-2のデコイ発現ベクターpBLAST45-msFLK-1(InvivoGen)を細胞に導入してのデコイの発現を確認する必要がある。その後に動物実験に取りかかる予定である。
|
