| 研究分担者 |
吉貴 達寛 滋賀医科大学, 医学部, 准教授 (80230704)
上仁 数義 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (90324590)
影山 進 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (50378452)
金 哲將 滋賀医科大学, 医学部, 非常勤講師 (10204968)
牛田 博 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (80418756)
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| 研究概要 |
これまでの研究から,間質性膀胱炎ではウロプラキン(UP)III遺伝子のエクソン4を欠失した選択的スプライシングバリアントが非常に重要であることが明らかになっている。このバリアントUPIII遺伝子ではエクソン4欠失部分以降でフレームシフトが起きる結果,正常には存在しないアミノ酸配列の蛋白質になる。このような「異物蛋白質」に対して自己抗体が産生されても不思議ではないため、検証材料として,まず当該変UPIII蛋白質を作製することとした。
この異常蛋白質を調製すべく,NM_006953 cds1-864(864bp)をヒト成人正常膀胱組織由来cDNAをtemplateとしてPCR反応を行い,目的のUPIII遺伝手を含むフラグメントを調製した。増幅したPCRフラグメントは,末端に付加した制限酵素による切断を行い,同様の制限酵素で処理したpET28aベクター(novagen)にクローニングし,ワンパスシークエンス解析によりクローニング領域に関して,配列情報と同一であることを確認した。完成したpET28a-UP3 plasmidDNAをtemplateに,エクソン4部分(489-571)を除くべく,reverse-primer(488-460),forward-primer(572-600)を用いてinversePCRを行うことでエクソン4欠損pET28a-UP3delta4ができた。配列確認されたクローンをBL21(DE3)RILにtransformし少量培養およびバッチ精製した。大量培養後,Niカラムで精製し,SDS-PAGEにより精製度合いを確認した。患者血清を一次抗体とし,作製された遺伝子組み換えUPIII蛋白質を対象にウェスタンブロットを実施したところ,一部の患者血清で反応性が認められた。
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