| 研究概要 |
妊娠マウスをケタミン、キシラジンにて麻酔後、胎児を取りだし、イソジンにて消毒後、断頭して脳組織を取り除き、嗅裂を含むように鼻粘膜を取り出しか。ペニシリン・ストレプトマイシンを含んだ生理食塩水にて組織を洗浄後、0.25%トリプシンにて組織を37℃にて15分間留置し、細胞を分離させ、ナイロンメッシュにて骨などの不要組織を除去し、回収した細胞に成長因子を加えた培養液で継代しか。ディッシュに付着する細胞と浮遊する細胞を分離し、浮遊細胞を継代しか。浮遊細胞は球状なneuro-sphereを形成し、12ヶ月以上継代することが出来た。マウス骨髄からも同様にsphereを形成する培養細胞が分離できたが、2ヶ月程すると、細胞はアポトーシスを起こし、消失していったのに対し、鼻粘膜由来の細胞は15ヶ月継代することができた。これらの細胞からRNAを抽出し、RT-PCRにて神経系マーカーの発現をみると、Musashil、Nestin、などの神経幹細胞を示唆する遺伝子の発現を認めた。内耳組織幹細胞セルラインを、sonic hedgehog,EGF,retinoic acid,BDNF(SERB)と共に培養すると、細胞分化が誘導され、Brn3.1、Math1、Myosin7aなどの有毛細胞マーカーが発現することが確認された。鼻粘膜由来の組織幹細胞でも、同様に共培養し、OMP(olfactory major protein)などの遺伝子が発現するか検討する。またこの細胞をBrdUにて標識後、正常マウスと嗅覚障害モデルマウスの鼻粘膜に注射し、OMPの発現が生じるか検討したい。
|
