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C1qtnf5遺伝子異常マウス作成のためC1qtnf5のcDNAをクローニングした。今回我々はPCRを用いたクローニング法を行った。近年high-fidelityのDNAポリメラーゼがいくつか開発され、それらの中でもKOD-plus-DNA polymerase(TOYOBO)は非常にfidelityが高く比較的長いcDNAのクローニングも可能となった。我々はマウス眼球を摘出後、網膜色素上皮およびこれの付着した網膜組織を分離し、AGPC法を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAからPoly(A)^+ RNAを精製し、これを用いてfirst strand cDNAを作成した。このfirst strand cDNAをテンプレートとして、MfrpおよびC1qtnf5の全長cDNAをKOD-plus-DNA polymeraseで増幅した。挿入効率を上げるためTOPOイソメラーゼIで活性化した3'-dT突出末端を持つ直鎖状のベクターであるpCR-Blunt II-TOPOベクター(invitrogen)を用いた。適切なサイズのインサートをもつプラスミドをミニプレップで確認後、精製し、DNAシークエンシングを行いcDNAに誤った塩基配列がないことを確認した。今後、クローニングしたcDNAを制限酵素を用いて切り出し、genomic libraryのスクリーニングに利用する。得られたgenomic DNA断片をターゲティングベクターにサブクローニングする。ES細胞(129Svev)を用いたエレクトロポレーション後、G418による薬剤耐性選別を行う。
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